In dieser Arbeit soll der mögliche Einfluss von CAR und PPARa auf die Regulation des Indy-Gens in Säugetierhepatozyten untersucht werden. Dazu wurden Rattenhepatozyten mit dem CAR-Aktivator Phenobarbital und dem PPARa-Agonisten WY 14643 stimuliert und anschließend die Indy mRNA, die Indy-Promotoraktivität und der 14C-Citrattransport untersucht. Die Ergebnisse und deren Konsequenzen werden in dieser Arbeit dargestellt.
Kalorische Restriktion verbessert die Gesundheit und verlängert die Lebensspanne über nahezu alle Speziesgrenzen hinweg. Hierbei kann durch Funktionsänderungen von Genen wie z.B. dem Indy („I am not dead-yet“)-Gen der Zustand kalorischer Restriktion simuliert und folglich die Lebenserwartung erhöht werden. Das in Drosophila melanogaster entdeckte Indy-Gen codiert einen Tricarboxylattransporter, der Intermediate des Citrat-Zyklus in Zellen transportiert. Diese können zur Energieversorgung des Organismus genutzt werden. Über die Regulation des Indy-Gens ist noch wenig bekannt.
In Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass die Indy-Expression in Drosophila malanogaster, Caenorabididtis elegans und Mus musculus durch Fasten reprimiert wurde. In Rattenhepatozyten dagegen wurde das Gen durch das Hungerhormon Glucagon
induziert. Im Fastenzustand werden noch weitere Gene hochreguliert, wie z.B die Transkriptionsfaktoren PPARa und CAR. Diese kontrollieren wiederum Gene des Energiestoffwechsels.
Unser Lebensstil - der Anteil an körperlicher Aktivität oder die Art und Menge der täglichen Nahrungsaufnahme - beeinflusst nicht nur das Auftreten bestimmter Erkrankungen sondern darüber hinaus unsere Lebenserwartung. Gerade das Ernährungsverhalten spielt dabei eine entscheidende Rolle. Eine den Bedarf übersteigende Nahrungsaufnahme führt langfristig zur Adipositas und erhöht das Risiko ernährungsbedingte Krankheiten wie Diabetes mellitus Typ II, Insulinresistenz, oder kardiovaskuläre Erkrankungen zu entwickeln. Dadurch sinkt die Lebenserwartung.
Dagegen ist es möglich durch eine reduzierte Kalorienzufuhr die Entstehung von Krankheiten zu vermeiden und so die Lebenserwartung zu erhöhen. Auch unabhängig von der Krankheitsvermeidung kann Kalorienrestriktion die Lebenserwartung verlängern, denn durch Verringerung der Nahrungsaufnahme wird nicht nur der Körperfettanteil reduziert sondern zudem der Alterungsprozess verlangsamt.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Verzeichnis der Abbildungen
Zusammenfassung
I. Einleitung
I.1 Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit
I.2 Das Indy-Gen und seine Funktion im Zustand kalorischer Restriktion
I.2.1 Struktur und Funktion des Indy-Genprodukts
I.2.2 Zusammenhang zwischen Indy-Expression und Lebenserwartung
I.3 Die Rolle von CAR und PPAR« im Energiemetabolismus
I.4 Ziel der Arbeit
II. Material und Methoden
ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
II.1 Isolierung und Reinigung von Hepatozyten nach Meredith
II.2 Hepatozytenkultivierung
II.2.1 Puffer und Lösungen
II.2.2 Durchführung der Hepatozytenkultivierung
II.3 Transfektion von primären Rattenhepatozyten
II.3.1 Puffer und Lösungen
II.3.2 Prinzip
II.3.3 Transfektionscocktail
II.3.4 Durchführung der Transfektion primärer Hepatozyten
II.4 Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit Phenobarbital und WY14643
II.4.1 Puffer und Lösungen
II.4.2 Stimulation primärer Hepatozyten
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
II.5 Isolierung von Gesamt-RNA
II.5.1 Puffer und Lösungen
II.5.2 RNA-Isolierung
II.6 Synthese von cDNA-mRNA-Hybriden
II.6.1 Puffer und Lösungen
II.6.2 Synthese von cDNA
II.7 Real-Time-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
II.7.1 Puffer und Lösungen
II.7.2 Grundprinzip der RT-qPCR
II.7.3 Durchführung der RT-qPCR
II.8 Agarosegel-Elektrophorese
II.8.1 Puffer und Lösungen
II.8.2 Auftrennung der DNA im Agarosegel
II.8.3 Isolierung von DNA aus Agarosegel
II.9 Umklonierung der rIndy-Promotorfragmente aus pGL3-basic in den Vektor pGL4.83
II.9.1 Prinzip
II.9.2 Puffer und Lösungen
II.9.3 Ligation der rIndy-Promotorfragmente mit pGL4.83
II.10 Transformation der pGL4.83 - rIndyprom- Plasmide in E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation
II.10.1 Puffer und Lösungen
II.10.2 Transformation kompetenter E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation
II.11 Analyse rekombinanter Bakterienkolonien durch Plasmidpräparation im Mini-Maßstab
II.11.1 Puffer und Lösungen
II.11.2 Reinigung von Plasmid-DNA durch Affinitäts-Chromatographie im Mini-Maßstab
II.12 Charakterisierung von Plasmid-DNA durch Restriktionsspaltung
BIOCHEMISCHE METHODEN
II.13 Messung der Luciferase-Reportergenaktivität
II.13.1 Puffer und Lösungen
II.13.2 Grundprinzip des Luciferase Assay
II.13.3 Durchführung des Luciferase-Assays
II.13.4 Proteinbestimmung nach Bradford
II.14 Messung des Citrattransports in primäre Hepatozyten der Ratte
II.14.1 Puffer und Lösungen
II.14.2 Durchführung der Citrattransportstudie
III. Ergebnisse
III.1 Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
III.1.1 Induktion der Cyp2B1 mRNA
III.1.2 Induktion der Indy mRNA
III.2 Regulation der Cyp2B10 und Indy mRNA in mHC durch PB und WY14643
III.2.1 Induktion der Cyp2B10 bei C57B/6 Mäusen
III.2.2 Induktion der Indy mRNA bei C57B/6 Mäusen
III.2.3 Induktion der Cyp2B10 und Indy mRNA in 129SV Mäusen
III.3 Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergen- konstrukten durch PB und WY14643 in Rattenhepatozyten
III.3.1 Aktivierung des Cyp2B1-Promotors und der Indy-Promotorfragmente
III.4 Umklonierung der rIndy-Promotorfragmente in Renilla- Luciferasevektor
III.5 Regulation der Aktivität von Indy Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 mit Renilla-Luciferase als Reportergen
III.6 Modulation der Firefly-Luciferase mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY1463
III.7 Regulation des 14C-Citrattransports in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
IV. Diskussion
IV.1 Einfluss von PB und WY 14643 auf die Cyp2B- und IndyExpression in Ratten- und Maushepatozyten
IV.1.1 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Cyp2B1-Expression in Rattenhepatozyten
IV.1.2 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Indy-Expression in Rattenhepatozyten
IV.1.3 Einfluss von PB und WY 14643 auf den Citrattransport
IV.1.4 Vergleich der Indy- und Cyp2B-Regulation in Maus - und Rattenhepatozyten
IV.2 Mögliche physiologische Relevanz einer Regulation von Indy durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPAR «
IV.3 Luciferase als Reportergen bei der Untersuchung PB-abhängigen Aktivierung von Promotoren
IV.4 Schlussfolgerung
V. Literaturverzeichnis
D Anhang
E Danksagung
A Abkürzungsverzeichnis
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
B Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
C Zusammenfassung
Kalorische Restriktion verbessert die Gesundheit und verlängert die Lebensspanne über nahezu alle Speziesgrenzen hinweg. Hierbei kann durch Funktionsänderungen von Genen wie z.B. dem Indy („I am not dead-yet“)-Gen der Zustand kalorischer Restriktion simuliert und folglich die Lebenserwartung erhöht werden.
Das in Drosophila melanogaster entdeckte Indy-Gen codiert einen Tricarboxylattransporter, der Intermediate des Citrat-Zyklus in Zellen transportiert. Diese können zur Energieversorgung des Organismus genutzt werden. Über die Regulation des Indy-Gens ist noch wenig bekannt.
In Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass die Indy-Expression in Drosophila malanogaster, Caenorabididtis elegans und Mus musculus durch Fasten reprimiert wurde. In Rattenhepatozyten dagegen wurde das Gen durch das Hungerhormon Glucagon induziert. Im Fastenzustand werden noch weitere Gene hochreguliert, wie z.B die Transkriptionsfaktoren PPAR a und CAR. Diese kontrollieren wiederum Gene des Energiestoffwechsels. In dieser Arbeit sollte daher der mögliche Einfluss von CAR und PPAR a auf die Regulation des Indy-Gens in Säugetierhepatozyten untersucht werden. Dazu wurden Rattenhepatozyten mit dem CAR-Aktivator Phenobarbital und dem PPARa- Agonisten WY 14643 stimuliert und anschließend die Indy mRNA, die IndyPromotoraktivität und der 14C-Citrattransport untersucht.
Phenobarbital induzierte die Indy mRNA Expression in Ratten- und Maushepatozyten leicht, WY14643 steigerte diese Induktion in Ratten- aber nicht in Maushepatozyten. Indy konnte demnach als potentielles CAR-Zielgen identifiziert werden.
Im Gegensatz zur mRNA wurde die Indy-Promotoraktivität aller getesteten Konstrukte durch PB nicht gesteigert sondern gehemmt. Dies ist wahrscheinlich auf eine direkte Hemmung der Firefly-Luciferaseaktivität und nicht auf eine spezische Hemmung des IndyPromotors zurückzuführen. Die PB-induzierte Hemmung konnte in IndyPromotorkonstrukten mit der Renilla- Luciferase nicht beobachtet werden. Allerdings war auch hier keine Modulation der Indy-Promotoraktivität durch PB oder WY14643 zu erkennen. Dies lässt den Rückschluss zu, dass die für die CAR-abhängige Induktion der Indy mRNA verantwortlichen Elemente in den getesteten Promotorfragmenten nicht enthalten sind.
In einem funktionellen Assay konnte keine Modulation des 14-Citrattransports in Rattenhepatozyten durch PB oder WY14643 gemessen werden. Dies steht im Widerspruch zur Glucagon-abhhängigen Induktion der Indy mRNA, bei der ein signikanter Anstieg des Citrattransports gemessen werden konnte.
I. Einleitung
Unser Lebensstil - der Anteil an körperlicher Aktivität oder die Art und Menge der täglichen Nahrungsaufnahme - beeinflusst nicht nur das Auftreten bestimmter Erkrankungen sondern darüber hinaus unsere Lebenserwartung. Gerade das Ernährungsverhalten spielt dabei eine entscheidende Rolle.
Eine den Bedarf übersteigende Nahrungsaufnahme führt langfristig zur Adipositas und erhöht das Risiko ernährungsbedingte Krankheiten wie Diabetes mellitus Typ II, Insulinresistenz, oder kardiovaskuläre Erkrankungen zu entwickeln. Dadurch sinkt die Lebenserwartung 1.
Dagegen ist es möglich durch eine reduzierte Kalorienzufuhr die Entstehung von Krankheiten zu vermeiden und so die Lebenserwartung zu erhöhen 2.
Auch unabhängig von der Krankheitsvermeidung kann Kalorienrestriktion die Lebenserwartung verlängern, denn durch Verringerung der Nahrungsaufnahme wird nicht nur der Körperfettanteil reduziert sondern zudem der Alterungsprozess verlangsamt 3. In einigen Genen gibt es Polymorphismen, die den Einfluss der kalorischen Restriktion auf die Verlängerung der Lebensspanne vermitteln [3-6].
Davon sind auch Gene betroffen, deren Funktionsänderung eine Kalorienrestriktion simuliert, beispielsweise Indy 9.
I.1 Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit
Unter der kalorischen Restriktion versteht man die Reduktion der totalen Kalorienzufuhr um mehr als 30 % ohne gleichzeitige Mangelernährung 6. Sie wird durch niedrige Plasmakonzentrationen von Glucose, anabolen Hormonen (z.B. Insulin) und Wachstumsfaktoren (z.B IGF) charakterisiert. Der Energiebedarf des Organismus wird hauptsächlich durch eine verstärkte Fettsäureoxidation gedeckt. Zusätzlich wird durch geringere Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) der oxidative Stress auf die Zellen verringert bei gleichzeitiger Beschleunigung des Protein-Turnover von bereits geschädigten Proteinen. Somit wird einer möglichen Zellschädigung vorgebeugt 3. Die Effekte kalorischer Restriktion konnten anhand mehrerer Untersuchungen durch Modulation verschiedener Gene ermittelt werden. Diese Gene sind auch gleichzeitig Faktoren, die mit Langlebigkeit assoziiert werden, wie beispielsweise p53, Sirtuine (SIR), das Insulinrezeptorsubstrat (IRS), TOR, die AMP-Kinase sowie Indy [3-8].
1.2 Das Indy-Gen und seine Funktion im Zustand kalorischer Restriktion
1.2.1 Struktur und Funktion des Indy-Genprodukts
Indy, eine Kurzform für „ I am n ot d ead y et“, ist ein Gen, das erstmals in Drosophila melanogaster entdeckt wurde 9. Drosophila Indy sowie seine Homologe in Caenorabididtis elegans und Säugern werden vorrangig in Organen des Intermediärstoffwechsels exprimiert [10-12]. In Säugetierzellen beispielsweise zeigen die elektrogenen Transporter der SLC13- Familie die größte Homologie zu Drosophila Indy 13. Dabei hat sich der Natrium gekoppelte Citrat Transporter (NaCT), kodiert durch das SLC13A5-Gen, als funktionell und strukturell ähnlichster Transporter herausgestellt. Er ist vor allem in der Leber der untersuchten Säugetiere zu finden 14.
Das Indy-Gen codiert ein Transmembranprotein, welches Citrat, Succinat und andere Intermediate des Citrat- Zyklus effektiv transportiert. Die Aufnahme dieser Intermediate in die Zelle ermöglicht deren Einschleusung in verschiedene metabolische Kreisläufe vor allem in den Citrat- Zyklus, die Gluconeogense oder in die Fettsäure-und Cholesterolsynthese der Leber [13-15].
Trotz der Homologie bezüglich der Substratspezifität von Indy und seinen Orthologen variieren dessen Eigenschaften zwischen den Spezies stark. So ist der Citrattransport bei NaCT Na+- abhängig und elektrogen während Drosophila Indy seine Substrate Na+- unabhängig und elektroneutral transportiert. Auch zwischen den NaCT der verschiedenen Säugetierspezies zeigen sich Unterschiede. So wirken Lithium-Ionen stimulierend auf den humanen NaCT, wohingegen Li+ sich auf den Citrattransport durch den Nagetier-NaCT hemmend auswirkt [16,17].
1.2.2 Zusammenhang zwischen Indy-Expression und Lebenserwartung
In allen bisher untersuchten Spezies führte eine Downregulation des Indy-Gens zur Lebensverlängerung. Unter Umständen signalisiert die verringerte Citrataufnahme dem Organismus einen Energiemangelzustand, welcher der Stoffwechsellage bei reduzierter Nahrungsaufnahme entspricht. So wiesen im Vergleich Fliegen mit einer Mutation im Indy-Gen einen ähnlichen Phänotyp auf, wie kalorisch restriktierte Fliegen [9,18]. Dies äußerte sich in einer erhöhten Geotaxis und metabolischen Rate der Fliegen sowie Reduzierung des Körperfettanteils.
Ein ähnliches Phänomen konnte auch am Mausmodell festgestellt werden. In IndyKnockout Mäusen (mIndy'/_) wurde der Effekt der Indy-Deletion auf Energiespeicher und die Energiehomoöstase untersucht. Im Vergleich zu Mäusen, bei denen Indy nicht beeinträchtigt war (mIndy+/+), wurde bei mIndy-/-- Mäusen ein reduziertes Körpergewicht festgestellt 19. Weiterhin war die Lipidoxidation und mitochondriale Biogenese in primären Hepatozyten der mIndy-/-- Mäuse erhöht, die hepatische Lipoacidogenese in der Leber sowie Lipidakkumulation in der Skelettmuskulatur vermindert. Außerdem wurden geringe Plasmaglucose-und insulinkonzentrationen bei mIndy-/-- Mäusen gemessen sowie eine reduzierte hepatische Glukoseproduktion und verbesserte Glucoseaufnahme in die Skelettmuskulatur festgestellt 19.
Als stoffwechselrelevantes Gen sind verschiedene Regulationsmechanismen der IndyExpression denkbar. So wirken sich bestimmte Signalmoleküle, die Teil der Fastenadaptation sind, auch auf die Transkriptionshäufigkeit von Indy aus. In Drosophila malanogaster, Caenorabididtis elegans und Mus musculus konnte nachgeweisen werden, dass die Indy-Genexpression durch Fasten reprimiert wurde [4,11,19]. Dem widersprechen Untersuchungen in Rattenhepatozyten, bei denen Indy durch das katabole Hormon Glucagon, welches im Fasten vermehrt vorliegt, induziert wurde [20,21].
I.3 Die Rolle von CAR und PPAR « im Energiemetabolismus
In der Regulation der Fastenadaptation sind verschiedene Signalmoleküle involviert, um den Organismus vor dem Verlust wertvoller Energie zu schützen.
Neben der hormonellen Regulation durch Insulin und Glucagon sowie die metabolische Beeinflussung in Abhängigkeit vom Glucosespiegel ist auch der Fettsäurespiegel ein wichtiger Regulator in der Fastenadaptation. Zwei beteiligte Faktoren sind hierbei der Constitutive Androstan Rezeptor (CAR) und der Peroxysomen-proliferator-aktivierter- Rezeptor-alpha (PPAR a) 22. Diese sind nukleäre Rezeptoren, die als Transkriptionsfaktoren dienen, sobald sie lipophile Liganden im Zellinnern binden.
Im Fasten führt der Anstieg an freien Fettsäuren zur Aktivierung von PPAR a. Dieser fördert nicht nur die Induktion von Zielgenen des Fettsäuretransports, der Fettsäureoxidation und Gluconeogenese, sondern auch die Induktion von CAR. Die Aktivierung von CA R führt zur Expression von weiteren Genen wie z.B. von Transportern (z.N. MRP2 und OATP1A4) und Enzymen (z.B Cyp2 B -Enzyme), welche Auswirkungen auf den Ab b au von Xenobiotika und Hormonen (z.B Sc h ilddrüsenhormone) haben [23-25].
Die Kommunikation von P P AR a und CAR im Energiestoffwechsel ko n nte beispielsweise durch den Synergismus v on Phenobarbital und Fettsäure-Agonist W Y 14643 bei dem Abbau der Schilddrüse n hormone T3 und T4 in primären Rattenhepatozyten nachgewiesen werden [2 6 ]. Ebenso wurden durch die PPAR a - abhängige CARInduktion unter anderem s inkende Cholesterol- und Glukosespiegel in Mausleberzellen festgestellt 27. Durch C A R-knockout in Mäusen wurde gezeigt, d a ss ein Verlust von CAR beispielweise zu einer verminderten Resistenz gegenüber G ewichtsverlust bei kalorischer Restriktion füh r en kann 28.
I.4 Ziel der Arbeit
Die nukleären Rezeptoren CAR und PPAR a sind zentrale Regulator e n in der Adaptation der Energiehomöostase, über deren Aktivierung verschiedene Gene des Intermediärstoffwechsels i n duziert werden. Dies lässt vermuten, dass auch das Indy-Gen durch CAR und PPAR a beeinflusst wird. Ziel dieser Arbeit ist es diesen möglichen Einfluss von CAR und P P AR a auf die Indy-Genregulation in Säug e tierhepatozyten zu untersuchen.
Der vermutete Mechanism u s lässt sich der nachstehenden Abbildung e ntnehmen:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.1 Modell für die CAR-abhängige Induktion von Indy in Kooperation mit PPAR a. Durch Stimulation mit WY 14643 (PPARa-Agonist) kommt es zur Induktion der CAR-Expression über PPARa. Nach einer weiteren Aktivierung von CAR durch PB könnte dieser dann die INDY-mRNA induzieren. Letztere könnte so zu einer erhöhten Expression des Tricarboxylat- transporters in der Zellme mbran führen, was den Hepatozyten zur Folge hätte.
II. Material und Methoden
ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
11.1 Isolierung und Reinigung von Hepatozyten nach Meredith
Für die Bereitstellung von Hepatozyten wurden männliche Wistar-Ratten (200-350 g) gewählt. Hepatozyten wurden durch Perfusion mit Ca2+-freiem und EDTA-haltigem Puffer aus dem Zellverband der Leber gelöst und anschließend durch eine niedrigtourige Zentrifugation und eine nachfolgende Percoll-Dichtegradienten-Zentrifugation von Nichtparenchymzellen und Zelltrümmern abgetrennt und gereinigt 21. Die Hepatozytenisolierung aus den Ratten erfolgte durch Mitarbeiter der Abteilung „Biochemie der Ernährung“.
11.2 Hepatozytenkultivierung
II.2.1 Puffer und Lösungen
Wenn nicht anders angegeben wurden die Puffer und Lösungen durch einen 0,2 pm-Filter sterilfiltriert und in autoklavierten Glasflaschen bei 4 °C aufbewahrt. Bei dem verwendeten Wasser handelte es sich um autoklaviertes Reinstwasser.
Willliams E Medium
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Alle Medien wurden vor der Verwendung auf 37°C temp eriert.
II.2.2 Durchführung der Hepatozytenkultivierung
Die Hepatozyten wurden nach ihrer Isolierung in M199 Kulturmedium I suspendiert. Zur Verbesserung der Transfektionseffizienz wurden dem Medium gegebenenfalls 2,5 pg/ml 25-Hydroxycholesterol zugesetzt (M199 Transfektionsmedium). Die Hepatozyten wurden in 35 mm- Zellkulturschalen in einer Dichte von 1,0 x 106 Hepatozyten/1,5 ml Medium bzw. bei nachfolgender Transfektion zu 0,7 x 106 Hepatozyten/1,5 ml Medium ausplattiert. Nach einer Anheftungsphase von 4 h bzw. 5 h bei transfizierten Zellen folgte ein Mediumwechsel mit 1 ml Williams E Kulturmedium I/Platte, welches kein neonatales Kälberserum (NCS) mehr enthielt. Die Inkubation der Hepatozyten erfolgte in Begasungsbrutschränken in einer wasserdampfgesättigten Atmosphäre mit 5 % (v/v) CO2 bei 37 °C bzw. mit 3 % CO 2 während der Anheftungsphase bei transfizierten Zellen.
II.3 Transfektion von primären Rattenhepatozyten
II.3.1 Puffer und Lösungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N NaOH auf pH 7,05 eingestellt. Die Lösung wurde durch einen 0,2 pm-Filter sterilfiltriert und in Aliquots von 10 ml bei -20 °C gelagert.
II.3.2 Prinzip
Für die Untersuchung der CAR-abhängigen Modulation der Indy-Promotoraktivität wurden primäre Rattenhepatozyten mit Indypromotor-Reportergenkonstrukten nach der Ca3PO4- Methode transfiziert. Bei dieser Transfektionsmethode wird die in die Zellen einzubringende DNA an präzipitiertes Ca3PO4 gebunden und die DNA/Ca3PO4-Präzipitate von den Hepatozyten über Endocytose aufgenommen.
II.3.3 Transfektionscocktail
Für die Transfektion der Rattenhepatozyten wurden Transfektionsansätze nach folgendem Schema angesetzt:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die einzelnen Lösungen wurden in dieser Reihenfolge zugegeben, um die Ausbildung von Calciumphosphat-Präzipitaten ohne DNA zu vermeiden. Nach 20 minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Ausbildung von DNA/Ca3PO4- Präzipitaten durch eine Trübung der Ansätze sichtbar.
II.3.4 Durchführung der Transfektion primärer Hepatozyten
Die Isolierung der Hepatozyten für die Transfektion erfolgte auch hier wie unter Punkt II.1 beschrieben. Die Kultivierung erfolgte in M199 Transfektionsmedium. Dabei wurden folgende Reportergenkonstrukte eingesetzt:
Tabelle 1 Verwendete Reportergenkonstrukte
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Transfektionsansätze wurden nach dem in Punkt II.3.3 genannten Schema in Polystyrolröhrchen angesetzt und durch leichtes Schwenken gemischt. Pro 3,5 cm- Kulturschale wurden 150 pl des jeweiligen Transfektionsansatzes auf die in 1,5 ml Medium frisch ausplattierten Hepatozyten gegeben und nach leichtem Schwenken der Platten im Brutschrank bei 3% CO2 für 5 h inkubiert. Anschließend erfolgte ein Mediumwechsel mit 1 ml Williams E Kulturmedium I. Nach dem ersten Mediumwechsel wurden die Hepatozyten, wenn nicht anders angegeben, wie unter II.4.1 beschrieben, weiterbehandelt.
II.4 Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit Phenobarbital und WY14643
II.4.1 Puffer und Lösungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Der pH-Wert der Lösung wurde mit NaOH 5N auf pH 7,5 eingestellt.
II.4.2 Stimulation primärer Hepatozyten
Nach 24 h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt und die Zellen ab diesem Zeitpunkt mit der hyperphysiologischen Insulinkonzentration von 870 nM Insulin (Williams E Kulturmedium II) inkubiert. Die Hälfte der Hepatozyten wurde zu diesem Zeitpunkt mit 1 mM Phenobarbital (PB) stimuliert. Nach weiteren 24 h (48 h Gesamtkultur) wurde wieder ein Mediumwechsel mit Williams E Kulturmedium II durchgeführt und die Hepatozyten für weitere 24 h mit 0,01 % DMSO oder 10 pM WY 14643 (Zellen welche vorher nicht mit PB behandelt wurden) bzw. mit 0,01 % DMSO + 1 mM PB oder mit 1 mM PB + 10 pM WY 14643 (Zellen welche vorher für 24 h mit PB behandelt wurden) stimuliert. Die Stimulationsansätze für die Untersuchung der mRNA erfolgten jeweils in Doppelbestimmung, bei Promotoruntersuchungen und Bestimmung des Citrattransports in Dreifachbestimmungen. Nach 48 h Kultur wurden die Hepatozyten für die Isolierung der RNA und die Promotoruntersuchungen zweimal mit 1x PBS Puffer/Platte gewaschen, in flüssigen Stickstoff schockgefroren und die Zellen anschließend bei - 70°} gelagert. Für die Untersuchung des Citrattransports wurden die Hepatozyten 1x mit NaCl-Puffer gewaschen und dann sofort in der Transportstudie eingesetzt.
Tabelle 2 Stimulationsschema der primären Rattenhepatozyten
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
II.5 Isolierung von Gesamt-RNA
II.5.1 Puffer und Lösungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Reinstwasser wurde mit 0,1 % DEPC versetzt und für 24 h bei 37 °C inkubiert, um die Inaktvierung der RNasen zu ermöglichen. Das DEPC wurde durch Autoklavieren zersetzt. Alle Puffer und Lösungen wurden mit DEPC-Wasser angesetzt, um den Abbau von RNA durch exogene RNAasen zu verhindern. Die für die RNA-Isolierung benötigten Substanzen wurden dem Gene MATRIX Universal RNA Purification-System der Firma EURx entnommen, welches für die Isolierung von Gesamt-RNA verwendet wurde. Dazu gehörten der RL Puffer, DN1 Waschpuffer, RBW-Waschpuffer sowie RNase-freies Wasser. Dabei wurde der RL Puffer unmittelbar vor Gebrauch mit 10 pl ß- Mercaptoethanol pro 1 ml versetzt. Die Lagerung der Substanzen erfolgte bei 4 °C. Über die genaue Zusammensetzung der Puffer machte der Hersteller keine Angaben.
II.5.2 RNA-Isolierung
Die bei -70°C gelagerten primären Hepatozyten wurde n unter Eiskühlung mit je 100 pl RL Puffer/Platte zur Lysierung der Zellen versetzt. Die unter gleichen Bedingungen kultivierten Doppelbestimmungen wurden abgeschabt und jeweils zusammen in ein autoklaviertes 1,5 ml Reaktionsgefäßgefäß überführt. Nach Mischen des Zelllysats wurde dieses auf eine ebenfalls in dem System enthaltene Homogenisation Spin -Säule überführt und 2 min zentrifugiert, was der Homogenisierung des Zelllysats und der Entfernung der DNA diente.
Das erhaltene Filtrat wurde anschließend mit 350 pl Ethanol 70 % versetzt, auf eine ebenfalls im System enthaltene RNA-Bindungssäule überführt und 1 min zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die auf der Säulenmatrix gebundene RNA durch 1 minütige Zentrifugation mit 400 pl DN1-Waschpuffer gewaschen, wobei auf der Säule gebundene genomische DNA entfernt wurde. Der Durchfluss wurde ebenfalls wieder verworfen und zwei weitere Waschschritte mit 650 pl bzw. 350 pl RBW-Waschpuffer durch 1-bzw. 2-minütige Zentrifugation durchgeführt. Der jeweilige Durchfluss wurde verworfen, die Säule in ein neues autoklaviertes 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und anschließend die RNA mit Hilfe von 50 pl RNase freiem Wasser durch 1-minütige Zentrifugation eluiert. Die Zentrifugationsschritte erfolgten bei 11.000 rpm.
Zur Bestimmung der Reinheit und Konzentration der isolierten RNA wurden 5 pl der erhaltenen RNA-Proben 1:100 mit DEPC-Wasser verdünnt. Anschließend wurde die Extinktion der RNA-Proben bei 260 nm, dem Absorptionsmaximum der aromatischen Pyrimidin-und Purinringe der Nukleinsäurebasen, am Photometer gemessen. Der Wert des Quotienten aus der Absorption bei 260 nm und 280 nm (Absorptionsmaximum von Proteinen) sollte bei einer gereinigten RNA-Lösung zwischen 1,5 und 2,0 liegen. Die Konzentration an RNA wurde durch die nachfolgende Berechnung ermittelt:
RNA-Konzentration [ng/pl]= A E bei 260 nm x Verdünnungsfaktor x 40 ng/pl.
Nach der Messung wurden die RNA-Proben bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -70°C gelagert.
II.6 Synthese von cDNA-mRNA-Hybriden
II.6.1 Puffer und Lösungen
Die Lösungen wurden in Nuklease-freiem Wasser angesetzt. Die Lagerung erfolgte in Aliquoten bei -20 °C.
Primer Poly d(T)12-18
Poly d(T)12.18_ Lösung wurde in einer Konzentration von 500 ng/pl in H2O gelöst.
Hexanukleotid-Random-Primer Mix
Random-Hexamer-Primer wurden in einer Konzentration von 200 ng/pl in H2O gelöst. 5x Reaktionspuffer für M-MUL V T und (H Minus) M-MUL V RT (MBI Fermentas)
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Der Puffer war den beiden Reverd Aid TM M-MUL V Reversen Transkriptasen beigefügt.
Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs) (10 mM)
Die Desoxyribonukleotidtriphosphate (dATP, GTP, dCTP, dTTP) wurden in einer Konzentration von 100 mM vorliegend gemischt und dann 1:10 verdünnt.
ReverdAid™ M-MUL V Reverse Transkriptase
Die Lösung war in einer Konzentration von 200 U/pl im ReverdAid™ H Minus First Stand cDNA Synthese Kit enthalten.
ReverdAid™ (H Minus) M-MUL V Reverse Transkriptase
Die Lösung war in einer Konzentration von 200 U/pl im ReverdAid™ H Minus First Stand cDNA Synthese Kit enthalten. Diese Transkriptase ist eine genetisch modifizierte M-MUL V Reverse Transkriptase, der die RNAase-Aktivität fehlt. Das Entfernen der RNAase H- Aktivität erhöht die Effizienz der reversen Transkription.
11.6.2 Synthese von cDNA
Für die cDNA-Synthese wurde die ReverdAid™ H Minus M-MUL V Reverse Transkriptase bei RNA-Mengen <1 pg und die ReverdAid™ M-MUL V Reverse Transkriptase bei höheren RNA-Mengen verwendet. Hierbei handelt es sich um in E.coli vermehrte retrovirale Polymerasen (Moloney-Murine-Leukemia-Virus), die in Gegenwart von DNA- Oligonukleotiden, als Primer, und ssRNA, als vorliegende Matrize, DNA synthetisiert. Für die cDNA Synthese wurde zumeist 2 pg RNA eingesetzt und mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 11 pl aufgefüllt. Zu diesen Lösungen wurden je 1 pl Poly d(T)12-18 (500 ng/pl) und 1 pl Hexanukleotid Random Primer (200 ng/pl) gegeben. Dieses Gemisch wurde anschließend für 5 min bei 70 °C erwärmt zur Denaturierung von möglichen Sekundärstrukturen der RNA. Nachfolgend wurde das Gemisch auf 6 °C gekühlt, um die Anlagerung der Primer zu ermöglichen und die Neubildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Anschließend wurden 4 pl 5x RT Puffer, 2 pl einer 10 mM dNTP -Lösung sowie 1 pl (200U) der jeweiligen Reversen Transkriptase zugegeben. Alle weiteren Schritte erfolgten im Thermocycler (T3000, Biometra). Für die Reverse Transkription wurde der Ansatz zunächst für 10 min bei 25 °C und anschließend für 90 min bei 42 °C inkubiert. Durch 10-minütiges Erhitzen auf 70 °C wurde die Reverse Transkriptase inaktiviert und damit die Reaktion beendet. Die Proben wurden anschließend 1:10 mit Nuklease-freiem Wasser verdünnt und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
II.7 Real-Time-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
II.7.1 Puffer und Lösungen
Für die qPCR wurde der MaximaTMSYBR Green/Fluorescin qPCR Master Mix (2x) der Firma Fermentas verwendet. Dieser enthielt dNTPs, dUTPs, SYBR ® Green I, Maxima™ SYBR Green qPCR Buffer, sowie die MaximaTM Hot Start Taq Polymerase in einem Puffer. Über die Zusammensetzung des Puffers macht der Hersteller keine Angaben.
11.7.2 Grundprinzip der RT-qPCR
Bei der PCR (Polymerase Chain Reaction) werden bestimmte DNA-Abschnitte mit Hilfe der DNA-Polymerase vervielfältigt. Die qRT-PCR ist die Kombination der PCR-Methode mit einer gleichzeitigen Quantifizierung der amplifizierten DNA, nach jedem Zyklus der PCR.
Die Quantifizierung wird durch Fluoreszenzmessungen in der exponentiellen Phase der PCR noch während des Laufes („Real Time“) detektiert, wobei die Fluoreszenz proportional mit der Menge der gebildeten PCR-Produkte zunimmt. Als Fluoreszenzfarbstoff wurde SYBR ® Green I verwendet. SYBR ® Green I ist ein asymmetrischer Cyan in-Farbstoff, der an die doppelsträngige DNA bindet. Der daraus resultierende DNA-Fluoreszenzfarbstoff-Komplex absorbiert blaues Licht bei einer Wellenlänge Amax = 494 nm und emittiert grünes Licht bei Amax = 521 nm. Die neusynthetisierte dsDNA kann somit anhand der Stärke des Fluoreszenzsignals erfasst werden. Dies dient gleichzeitig auch als Maß für die Quantifizierung der RNA-Menge. Das im Master Mix enthaltene Fluorescin dient hierbei der Normalisierung der erhaltenen Werte. Die Fluoreszenz dieser Substanz ist in allen Proben unabhängig vom DNA-Gehalt identisch.
Die RT-qPCR gibt allerdings keinen Aufschluss über die Art der erhaltenen PCR- Produkte. Durch eine anschließende Schmelzkurvenanalyse kann jedoch die Reinheit der entstandenen PCR-Produkte bestimmt und damit die Spezifität der PCR beurteilt werden. Dazu wird die DNA durch kontinuierliche Erhöhung der Temperatur von 50°} auf 95°C denaturiert und die einzelnen DNA-Fragmente anhand ihrer spezifischen Schmelztemperatur erfasst, denn bei einer bestimmten Schmelztemperatur werden aus dem neusynthetisierten Doppelstrang wieder zwei Einzelstränge. Dabei wird der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt und eine Fluoreszenzabnahme registriert.
Die quantitative Analyse der unbekannten cDNA-Proben erfolgte mit Hilfe der AA C (t) - Methode. Hierbei wird der jeweilige Schwellenzyklus (C(t)) beschrieben, bei dem das Fluoreszenzsignal der betrachteten cDNA erstmalig ein festgelegtes Fluoreszenzsignal übersteigt. Dies stellt den Beginn der exponentiellen Phase der Amplifikation dar. Durch die nachfolgende Beziehung kann dann die Expression des betrachteten Gens in der behandelten Probe als Vielfaches der Expression der Kontrolle dargestellt werden:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Als Referenzgen wurde bei der vorliegenden Untersuchung ß-Aktin verwendet.
[...]
1 s.Anhang:Restriktionskarte des Vektors pGL3-basic
2 s.Anhang:Restriktionskarte des Vektors pGL4.83
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