Polymerase Ketten Reaktion:
I. Überblick
1. Sinn und Zweck/ Prinzip
Vervielfältigung eines DNS Stücks durch DNS- Polymerase
2. Voraussetzung:
Die Sequenzen an beiden Enden des zu kopierenden DNS Stückes müssen bekannt sein, weil an beiden Enden ( jeweils am 3' Ende) ein Oliginucleotide angebracht werden muß
= Primer = Startstelle
3. Lieferanten Polymerase/ Restriktionsenzym = Bakterienstamm ( heiße Quellen = Hitzestabil)
II. Ablauf der PCR: ( Folie!!)
1. Denauterierung der DNS durch Hitze ( Trennung der Einzelstränge)
→2. Senkung der Temperatur Primer werden hinzugefügt
3. Erhitzung Polymerase synthetisiert komlimentären Einzelstrang
4. Denauterierung der entstandenen Einzelstränge
→Exponentielles Wachstum ( nach 30 Abläufen über 268 Millionen Kopien)
5. Analyse des Produkts
Einzelheiten der PCR:
I. Wichtig für Verlauf:
Richtige Konstruktion der Primer sonst keine Synthese oder falsche Abschnitte kopiert werden
→Sequenz komplimentär zu Enden
Außerdem Primer ca. 17 Basen lang weil sonst mehrere komplimentäre Stellen auf DNS
II. Reaktionstemperatur
Denauterierung: 940 C
Hybridvisierungstemperatur vom Primer abhängig, berechnen DNS- Synthese 740 C
Wichtig genaue Einhaltung der Temperatur weil sonst Primer falsch oder nicht anheftet.
Berechnung der Hybridvisierungstemperatur:
Hybridvisierungstemperatur (TH) liegt 20 C unter Schmelztemperatur
→(TM) TH = TM - 20 C
Berechnung der Schmeltemperatur:
TM = ( 4 ( G + C) + 2 ( A + T)0 C
G = Guanin Nucleotide auf Primer
Beispiel: (Tafel) 5´ AGACTCAGAGAGAACCC 3´
4G/ 5C/ 7A / 1T einsetzen = 520 C
Analyse der Produkte der PCR:
Mehrere Möglichkeiten:
1. Agarosegelelektrophese:
a. Produkt + Agarosegel + Ethidiumbromid = ein Band sichtbar Sonst Wiederholung des Experiments
b. Feststellung der Länge ( Deletion/ Insertion ??)
2. Sequenzanalyse der gewonnen DNS ( Folie):
Aufspaltung der DNS
Normaler und modifizierter ( Magnetkügelchen) Primer Denauterierung und Trennung der Stränge
Mit Enzym Sequenzase Molekül erkennen der Aminosequenz
Anwendungsgebiete:
1. DNS Analyse
Extreme Empfindlichkeit der PCR ( ein einziges DNS Molekül kann Matrize sein)
Gerichtsmedizin: - Untersuchung von Haare und Blutflecken
- Archäologie/ Paläontologie
Ermittlung winziger DNS Spuren in fossilem Material
2. Klinische Diagnose ( Folie):
Schnellen Analyse fraglicher Mutationen durch PCR
Gegensatz Früher
→Schneller Erkennung frühere Diagnose bei viruellen
→Erkrankungen ( Krebs) frühere Behandlungsmöglichkeit durch Erkennung der Symptome bevor sie auftreten
3. Vervielfältigung von RNA
RNA + Enzym + Reverse Transkriptase = einzelsträngiger cDNS- Strang Dann Zugabe der Primer und der Polymerase = PCR
Durch sog. RT-PCR messen des Mengenverhältnisse in verschieden Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten
Je höher mRNA Konzentration desto höhere Genaktivität
Wegen hohen Empfindlichkeit der PCR Messung weniger aktiver Gene möglich
4. Vergleichen verschiedener Genome ( Folie)
→Zufallsexperimente kurze Primer Stücke die an mehreren DNS Stücken anheften kann man die Gesamtstruktur erkennen, so dass man aus dem Bandenmuster etwas über die Organisation des Genomos erfährt. Evolutionsgeschichte: Festellen der Verwandtschaft zwischen den Lebewesen ( RAPD )
Beispiel:
→Fruchtkörper eines Hallimaschpilzes besaß immer die genau gleiche Genomstruktur ein riesiger Klon der sich über 1000000 m2 erstreckt und eines der ältesten Lebewesen dieser Erde ist.