Amplifikation und Klonierung von rDNA aus Sinorhizobium meliloti

Praktikum 'Genetik und Molekularbiologie gramnegativer Bakterien'

Praktikumsbericht / -arbeit , 2006 , 8 Seiten

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

In diesem Versuch soll die 16S-rDNA des stickstofffixierenden Endosymbionten
Sinorhizobium meliloti zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert und anschließend mit Hilfe von Transformation in E.coli kloniert werden.
Dazu wird zuerst die gesamte DNA der Bakterien in einem Schnellverfahren isoliert und
anschließend für die PCR eingesetzt. Diese ist in der Lage, auch aus einem komplexen DNAGemisch eine bestimmte Gensequenz zu amplifizieren, wichtig sind hierfür jedoch u.a. die richtige Wahl der Annealing-Temperatur und der Primer. Da es sich bei der 16S-rDNA um hochkonservierte Sequenzen handelt (die z.B. auch für taxonomische Bestimmungen eine bedeutende Rolle spielen), lassen sich hier unabhängig vom Bakterienstamm universelle Primer einsetzen. Die Annealing-Temperatur wird, genauso wie die Auswirkung des für die Replikation wichtigen Cofaktors Mg 2+, mithilfe mehrerer PCR-Ansätze getestet.
Nachdem mithilfe einer Gelelektrophorese der erfolgreichste Ansatz ausgewählt wurde (es muss sich eine kräftige, dominierende Bande bei 1,5 kb zeigen), wird das amplifizierte Gen in einen Vektor eingebaut und in den E.coli-Stamm JM109 transfomiert und anschließend kloniert. Aus 10 Einzelkulturen wird schließlich die Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse kontrolliert.
Damit fasst dieser Versuch eine große Bandbreite molekularbiologischer Techniken
zusammen, von der DNA-Isolierung über die PCR bis zur Transformation und Klonierung.

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Material und Methoden
2.1. Isolierung chromosomaler DNA (Schnellverfahren)
2.2. Ansetzen der PCR
2.3. Kontrolle der PCR
2.4. Klonierung der Amplifikats
2.5. Kontrolle der Transformation

3. Ergebnisse

4. Diskussion

1. Einleitung

In diesem Versuch soll die 16S-rDNA des stickstofffixierenden Endosymbionten Sinorhizobium meliloti zunächst mit Hilfe einer PCR amplifiziert und anschließend mit Hilfe von Transformation in E.coli kloniert werden.

Dazu wird zuerst die gesamte DNA der Bakterien in einem Schnellverfahren isoliert und anschließend für die PCR eingesetzt. Diese ist in der Lage, auch aus einem komplexen DNA-Gemisch eine bestimmte Gensequenz zu amplifizieren, wichtig sind hierfür jedoch u.a. die richtige Wahl der Annealing-Temperatur und der Primer. Da es sich bei der 16S-rDNA um hochkonservierte Sequenzen handelt (die z.B. auch für taxonomische Bestimmungen eine bedeutende Rolle spielen), lassen sich hier unabhängig vom Bakterienstamm universelle Primer einsetzen. Die Annealing-Temperatur wird, genauso wie die Auswirkung des für die Replikation wichtigen Cofaktors Mg 2+, mithilfe mehrerer PCR-Ansätze getestet.

Nachdem mithilfe einer Gelelektrophorese der erfolgreichste Ansatz ausgewählt wurde (es muss sich eine kräftige, dominierende Bande bei 1,5 kb zeigen), wird das amplifizierte Gen in einen Vektor eingebaut und in den E.coli -Stamm JM109 transfomiert und anschließend kloniert. Aus 10 Einzelkulturen wird schließlich die Plasmid-DNA isoliert und durch Restriktionsanalyse kontrolliert.

Damit fasst dieser Versuch eine große Bandbreite molekularbiologischer Techniken zusammen, von der DNA-Isolierung über die PCR bis zur Transformation und Klonierung.

2. Material und Methoden

Da das Skript eine ausführliche Beschreibung der Versuchsdurchführung enthält, sollen hier nur Ergänzungen und Abweichungen aufgeführt werden. Nur die DNA-Isolierung wird noch einmal Schritt für Schritt aufgeführt.

2.1. Isolierung chromosomaler DNA (Schnellverfahren)

1. Es wurden 2 mal 1,5 ml Zellen entnommen, 5 min bei 12000 rpm zentrifugiert, in je 1,5 ml kaltem NaCl gewaschen und dann in je 0,7 ml kaltem NaCl resuspendiert.
2. Die Suspensionen wurden 1 Stunde bei 4°C geschüttelt, anschließend zehnmal hin und her pipettiert (zum Lösen der Bakterienkapseln).
3. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in 200 µl Puffel L (enthält SDS) aufgenommen.
4. Zu der Lösung wurden 10 µl Lysozymlösung gegeben, anschließend wurde durch Pipettieren homogenisiert.
5. Anschließend wurden 66 µl 5M NaCl hinzugefügt, die Lösung geschwenkt und dann bei 4 °C und 12000 rpm für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt.
6. Es wurde mit 1 Volumen (= 276 µl) Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert, wobei solange geschwenkt wurde bis die Lösung milchig aussieht.
7. Wieder wurde bei 12000 zentrifugiert (3 min) und der Überstand (~ 170 µl) in ein neues Gefäß überführt.
8. 2,5 Volumen (= 425 µl) EtOH wurden hinzupipettiert und für 10 min bei -20°C stehengelassen, anschließend für 3 min bei 12000 rpm abzentrifugiert und nochmals mit 425 µl mit 70%-igem EtOH gewaschen.
9. Nach dem Lufttrocknen werden die beiden Proben in 25 µl Millipore-Wasser vereinigt.

2.2. Ansetzen der PCR

Für die PCR wurde ein zehnfacher Mastermix (ohneMgSO4) angesetzt:

50 µl 10x Puffer

15 µl dNTP (10 mM)

15 µl Primer (fD1 & rD1)

25 µl DNA

340 µl Millipore-Wasser

5 µl Pfx-Polymerase (liegt als AG-AK-Komplex vor und wird erst nach Aufkochen aktiv)

Von diesem Mix wurden pro Probe 45 µl eingesetzt, anschließend wurden nach folgendem Schema durch hinzufügen der MgSO4-Stammlösung (50 mM) und Wasser die erwünschten Mg2+-Konzentrationen eingestellt:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Proben 1.1. bis 1.4 wurden bei der PCR folgendem Programm unterworfen:

0,5 min 96°C – 0,5 min 55°C – 2 min 68°C, 30 Zyklen

Die Proben 2.1 bis 2.4 wurden dagegen einer Annealing-Temperatur von 65°C ausgesetzt.

2.3. Kontrolle der PCR

Es wurden je 5 µl des PCR-Produkts mit 2 µl GLB versetzt und anschließend in einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt. Als Referenz wurde der schon in früheren Versuchen verwendete Längenstandard benutzt.

2.4. Klonierung der Amplifikats

Für die Klonierung wurde mit Probe 2.1 weitergearbeitet. Die DNA wurde nicht mehr gefällt und der Taq-Polymerase-Ansatz wurde leicht verändert: anstatt dATPs wurden dNTPs verwendet, außerdem wurden nur 20 µl PCR-Produkt, dafür aber 22 µl Aqua bidest. eingesetzt. Anschließend wurde der Ansatz für 30 min bei 72°C inkubiert und dann ganz langsam abgekühlt.

[...]

• Hochschule: Humboldt-Universität zu Berlin
• Autor: Cornelia Dorn (Autor:in)
• Erscheinungsjahr: 2006
• Seiten: 8
• Katalognummer: V87892
• ISBN (eBook): 9783638035897
• Sprache: Deutsch
• Schlagworte: Amplifikation, Klonierung, Sinorhizobium