Vor dem Hintergrund einer qualitativen und quantitativen Bestimmung der Pigmente Astaxantin (Ast.), Lutein (Lut.) und β-Carotin (Car.) für ausgewählte phototrophe Mikroorganismen sind verschiedene Zellaufschlussmethoden sowie Extraktionsparameter hinsichtlich deren Eignung untersucht worden. Betrachtet wurden dabei unterschiedliche mechanische und physikalische Methoden.
Bei den pigmentbildenden Mikroalgen handelt es sich um Haem. pluvialis, Chr. zofingiensis und Chl. sorokiniana. Diese wurden mittels Tissue Lyser, Ultra Turrax, French Press, Lyophilisierung, Ultraschallhomogenisierung und wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen, anschließend extrahiert und auf ihren Pigmentgehalt untersucht.
Weiterhin fand im Rahmen dieser Arbeit ein Lösungsmittel-screening für die Extraktion der aufgeschlossenen Biomasse mittels accelerated solvent extraction (ASE) statt. Hierzu wurden nach vorausgehender Literaturrecherche Aceton, Dichlormethan, Ethylacetat, n-Hexan, Ethanol und Dimethylsulfoxid als geeignete Lösungsmittel ausgewählt. Weiterhin wurde die etablierte Standardmethode mit einer Lösungsmittelmischung aus Aceton und Methanol im Verhältnis 9 zu 1 (v/v) als Referenzextraktion verwendet. Hierbei sind identische, aufgeschlossene Proben von Haem. pluvialis extrahiert und anschließend miteinander verglichen worden.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Symbolverzeichnis
Zusammenfassung
1 Einleitung
2 Stand des Wissens - theoretische Grundlagen
2.1 Wertprodukte aus Algen
2.1.1 β-Carotin
2.1.2 Lutein
2.1.3 Astaxanthin
2.2 Produktionsorganismen
2.2.1 Haematococcus pluvialis
2.2.2 Chlorella sorokiniana
2.2.3 Chromochloris zofingiensis
2.3 Zellaufschluss
2.3.1 Enzymatischer Zellaufschluss
2.3.2 Chemischer Zellaufschluss
2.3.3 Mechanischer Zellaufschluss
2.4 Extraktion
2.4.1 Extraktionsmittel in der Lebensmitteltechnik
3 Zielstellung
4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Laborgeräte
4.1.2 Chemikalien
4.1.3 Verbrauchsmaterialien
4.2 Verwendete Mikroalgen
4.3 Verwendete Kultivierungsmedien
4.4 Kultivierung der verwendeten Mikroalgen
4.4.1 Vorkulturführung
4.4.2 PSM-Kultivierung
4.5 Bestimmung der Photonenflussdichte
4.6 Prozessbegleitende Analytik
4.6.1 Bestimmung der optischen Dichte
4.6.2 Bestimmung der Biotrockenmassekonzentration
4.7 Probenaufarbeitung
4.7.1 Ernte und Lyophilisierung
4.7.2 Zellaufschluss
4.7.3 Bestimmung des Aufschlussgrades C
4.7.4 Extraktion
4.7.4.1 Accelerated Solvent Extraction
4.7.4.2 Manuelle Extraktion
4.7.5 Probenvorbereitung für die HPLC
4.8 Durchführung der HPLC
4.9 Bestimmung des Pigmentgehaltes
5 Ergebnisse
5.1 Kultivierung
5.2 Zellaufschlüsse
5.3 Extraktion
5.3.1 Variation des Lösungsmittels
5.3.2 Variation der Temperatur
5.3.3 Variation der Extraktionszeit
5.3.4 Mehrzyklische Extraktion
5.3.5 Manuelle Extraktion
6 Fehlerbetrachtung
6.1 Massebestimmung sowie volumetrische Bestimmung von Flüssigkeiten
6.2 Vorbereitende Schritte für die Kultivierung
6.3 Prozessbegleitende Analytik
6.4 Aufschlussgrad C
6.5 HPLC
7 Diskussion
7.1 Allgemeine Vorgehensweise
7.2 Kultivierung der Mikroalgen
7.3 Vergleich der Zellaufschlussmethoden
7.4 Lösungsmittelwahl
7.5 Einfluss der Extraktionsparameter
7.6 Vergleich der ASE mit der manueller Methode
8 Ausblick
9 Literaturverzeichnis
10 Anhang
10.1 Abbildungsverzeichnis
10.2 Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Zusammenfassung
Vor dem Hintergrund einer qualitativen und quantitativen Bestimmung der Pigmente Astaxanthin, Lutein und β-Carotin für ausgewählte phototrophe Mikroorganismen sind verschiedene Zellaufschlussmethoden sowie Extraktionsparameter hinsichtlich deren Eignung untersucht worden. Betrachtet wurden dabei unterschiedliche mechanische und physikalische Methoden. Bei den pigmentbildenden Mikroalgen handelt es sich um Haematococcus pluvialis, Chromochloris zofingiensis und Chlorella sorokiniana. Diese wurden mittels Tissue Lyser, Ultra Turrax, French Press, Lyophilisierung, Ultraschallhomogenisierung und wiederholtes Einfrieren und Auftauen aufgeschlossen, anschließend extrahiert und auf ihren Pigmentgehalt untersucht. Hierbei ergab für Haematococcus pluvialis der Aufschluss per French Press die höchsten Pigmentgehalte aller Aufschlussmethoden (β-Carotin 0,21 µg∙mg-1, Astaxanthin 3,11 µg∙mg-1, Lutein 0,89 µg∙mg-1, jeweils bezogen auf die Biotrockenmasse). Für Chromochloris zofingiensis erwiesen sich sowohl die French Press, als auch der Tissue Lyser als adäquate Zellaufschlussmethoden. Hierbei wurden β-Carotingehalte von ca. 0,1 µg∙mg-1, Astaxanthingehalte von 1,15 µg∙mg-1, bzw. 1,29 µg∙mg-1 und Luteingehalte von 1,56 µg∙mg-1 bzw. 1,48 µg∙mg-1, jeweils bezogen auf die Biotrockenmasse, erreicht. Für Chlorella sorokiniana konnten mit Hilfe des Tissue Lysers maximale Pigmenthalte von 0,07 µg∙mg-1 für β-Carotin und 2,10 µg∙mg-1 für Lutein, jeweils bezogen auf die Biotrockenmasse, erzielt werden.
Weiterhin fand im Rahmen dieser Arbeit ein Lösungsmittel- screening für die Extraktion der aufgeschlossenen Biomasse mittels accelerated solvent extraction (ASE) statt. Hierzu wurden nach vorausgehender Literaturrecherche Aceton, Dichlormethan, Ethylacetat, n-Hexan, Ethanol und Dimethylsulfoxid als geeignete Lösungsmittel ausgewählt. Weiterhin wurde die etablierte Standardmethode mit einer Lösungsmittelmischung aus Aceton und Methanol im Verhältnis 9 zu 1 (v/v) als Referenzextraktion verwendet. Hierbei sind identische, aufgeschlossene Proben von Haematococcus pluvialis extrahiert und anschließend miteinander verglichen worden. Die Verwendung von Dichlormethan stellte sich als vielversprechend heraus. Die Gesamtpigmentausbeute konnte um den Faktor 1,4 im Vergleich zur vorherigen Standardmethode gesteigert werden.
In weiteren Versuchen wurde der Temperatureinfluss auf das Extraktionsergebnis untersucht. Hierbei wurde ein Optimum der Pigmentausbeuten bei 60 °C beobachtet. Für höhere Temperaturen von 80, 100 und 120 °C sind abnehmende Pigmentgehalte die Folge. Mit zunehmender Extraktionsdauer von 5, 10, 20 oder 30 Minuten konnte eine steigende Pigmentausbeute nachgewiesen werden. Das Optimum liegt hier bei einer Extraktionsdauer von 30 Minuten, wobei für die Bestimmung des Astaxanthingehaltes eine Extraktionszeit von 20 Minuten ausreichend ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass durch eine mehrzyklische Extraktion lediglich eine Erhöhung der Astaxanthinausbeute um 4 % im Vergleich zu einer monozyklischen Extraktion der gleichen Extraktionszeit erzielt werden kann.
Abschließend wurde ein Vergleich der accelerated solvent extraction mit einer manuellen Extraktionsmethode durchgeführt. Dabei konnten per durch diese Methode geringfügig reproduzierbarere Extraktionsergebnisse erzielt werden. Weiterhin erfolgt dabei die Extraktion unter definierten Bedingungen und automatisiert.
1 Einleitung
Mikroalgen zeichnen sich als mögliche Produzenten von chemischen Hochwertprodukten aus [Borowitzka 2013], [Pulz & Gross 2004]. Dabei ist ein wichtiges Carotinoid welches aus Algen gewonnen werden kann Astaxanthin [Ambati et al. 2014]. Für dessen Produktion ist Haematococcus pluvialis unter bestimmten Stressbedingungen geeignet [Grewe 2009]. Weitere Carotinoide die aus Algen gewonnen werden können, stellen β-Carotin und Lutein dar. Wie auch Astaxanthin haben diese positive Effekte als Antioxidantien und UV-Inhibitoren [Alves-Rodrigues & Shao 2004], [Vilchez et al. 2011; Duffosé et al. 2005]. Dadurch können sie altersbedingte Krankheiten vermindern und das Auftreten von Krebserkrankungen reduzieren [Vilchez et al. 2011]. Aufgrund dieser positiven Effekte werden sie als Lebensmittelzusatz, oder als Nahrungsergänzungsmittel verwendet [Duffosé et al. 2005]. Ein weiteres wichtiges Anwendungsgebiet von Astaxanthin ist als färbender Futtermittelzusatz in Aquakulturen [Higuera-Ciapara et al. 2006], [Vilchez et al. 2011], [Borowitzka 2013].
Die Preise für die Carotinoide liegen dabei zwischen 300 und 1500 US $∙kg-1 für β-Carotin [Borowitzka 2013] und 2500 US $∙kg-1 für Astaxanthin [Vilchez et al. 2011]. Das gesamte Marktvolumen für Carotinoide beträgt dabei 1,2 Mrd US $ für das Jahr 2010 [Borowitzka 2013], wobei 261 Mio US $ auf β-Carotin, 233 Mio US $ auf Lutein [BCC Research 2011] und 260 Mio US $ auf Astaxanthin [Vilchez et al. 2011] entfallen. Für das Jahr 2018 kann ein Marktvolumen von 1,4 Mrd US $ erreicht werden [BCC Research 2011]. Der Markt für Carotinoide weist somit großes Entwicklungspotential auf.
Bevor interessante Mikroalgenspezies hinsichtlich deren Carotinoidgehalt untersucht werden, ist es zunächst erforderlich, einen Aufarbeitungsprozess sowie eine qualitative und quantitative Analytikmethode zu etablieren. In Algen liegen die meisten Xanthophylle nicht in freier Form, sondern verestert mit Fettsäuren vor. Es können dabei Mono- oder Diester gebildet werden [Alves-Rodrigues & Shao 2004], [Ambati et al. 2014]. Diese befinden sich in Lipidglobuli im Cytoplasma oder in den Chloroplasten [Liu et al. 2014] und sind somit intrazellulär. Um diese quantifizieren zu können ist es nötig die Zellen aufzuschließen und die Pigmente freizusetzen. Hierbei ist es wiederum wichtig den Zellaufschluss möglichst vollständig durchzuführen und gleichzeitig eine Zerstörung des Produktes durch Hitzeentwicklung, Oxidation oder hohen pH-Wert zu vermeiden [Craft & Soares 1992], [Rao et al. 2007]. Nach dem Zellaufschluss liegt das Wertprodukt in einem komplexen Gemisch aus Proteinen, Lipiden Organellen und weiteren Zellbestandteilen vor. Zur selektiven Abtrennung der Carotinoide bietet sich das Verfahren der Extraktion an [Harrison 2003]. Hierbei ist es von größter Wichtigkeit ein geeignetes Lösungsmittel zu finden. Dieses soll hohe Löslichkeiten für alle Pigmente aufweisen. Die Löslichkeit der Carotinoide in vielen Lösungsmitteln ist jedoch sehr gering [Craft & Soares 1992], [Johnson & An 1991]. Weiterhin sind die Löslichkeitsdaten nur für wenige Lösungsmittel überhaupt bekannt. Zuletzt müssen auch Isomerisierungen oder sonstige Umwandlungsreaktionen der Pigmente im Lösungsmittel so gering wie möglich sein, da die Stabilität von Pigmenten in organischen Lösungsmitteln begrenzt ist [Craft & Soares 1992], [Yuan & Chen 1999]. Basierend auf der qualitativen und quantitativen Methode können im Anschluss potentielle Mikroalgen hinsichtlich des Carotinoidgehalt optimiert werden.
2 Stand des Wissens - theoretische Grundlagen
2.1 Wertprodukte aus Algen
Algen weisen eine große biologische Vielfalt auf. Die Anzahl ihrer Vertreter wird auf mehr als 200∙000 verschiedene Arten geschätzt [Grewe 2009], [Pulz & Gross 2004]. Es ist somit wenig verwunderlich, dass das Potential an möglichen Wertprodukten sehr groß ist. Für die industrielle Verwendung von Mikroalgen kann zwischen drei generellen Fällen unterschieden werden. Zum einen kann die Biomasse ohne Aufschluss und Aufarbeitung verwendet werden. Hieraus ergeben sich typische Anwendungsfelder z.B. als Tierfuttermittel, besonders in Aquakulturen, Healthy Foods und biologischer Dünger (z.B. Spirulina und Chlorella Spezies) [Pulz & Gross 2004]. Weiterhin können Produkte von den Zellen sekretiert werden. Hier sind besonders extrazelluläre Polysaccharide zu nennen. Gewonnen werden können diese beispielsweise aus Porphyridium und Rhodella Spezies [Borowitzka 2013]. Die weitaus wertvolleren und zahlreicheren biochemischen Produkte befinden sich jedoch in der Zelle. Es ist somit erforderlich die Zellen aufzuschließen, um diese Produkte zugänglich zu machen [Chisti & Moo-Young 1986], [Harrison 2011]. Die Wertprodukte die aus den Algenzellen gewonnen werden können, sind sehr vielseitig. Phycobilyproteine, namentlich Phycocyanin, Phycoerythrin und Allophycocyanin sind Proteinpigmente, die ausschließlich in Mikroalgen und Cyanobakterien zu finden sind [Pulz & Gross 2004]. Sie werden als Lebensmittel- und Kosmetikfarbstoffe eingesetzt und haben zahlreiche weitere Anwendungsgebiete, z. B. als Fluoreszens- tag oder Antioxidationsmittel [Borowitzka 2013]. Gewonnen werden beispielsweise Phycoerythrin aus Porphyridium purpureum oder Phycocyanin aus Arthrospira platensis [Eriksen 2008], [Pulz & Gross 2004]. Des Weiteren sind Mikroalgen reich an Fettsäuren. Manche eukaryotischen Mikroalgen sind unter bestimmten Bedingungen in der Lage zwischen 50 und 75 % ihrer Biotrockenmasse an Lipiden zu akkumulieren [Pignolet et al. 2013]. Besonders die langkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren, wie Docosahexaensäure, Eicosapentaensäure, Arachidonsäure und γ-Linolensäure sind hier von Interesse [Borowitzka 2013]. Diese können kardiovaskuläre Erkrankungen vorbeugen und die Gehirnentwicklung und Funktion unterstützen [Ruxton et al. 2004]. Aufgrund dessen werden sie in Pharmazeutika, Nahrungsmitteln und Kosmetika eingesetzt [Pulz & Gross 2004]. Die Liste weiterer Wertprodukte aus Mikroalgen ist lang und im Zuge einer erfolgreichen biotechnologischen Anwendung ist es wichtig, die geeignete Alge für die jeweilige Anwendung zu finden [Pulz & Gross 2004]. Im weiteren Verlauf soll im Besonderen auf Stoffe der Klasse der Carotinoide und Xantophylle eingegangen werden, welche im Rahmen dieser Arbeit besondere Beachtung finden.
2.1.1 β-Carotin
β-Carotin ist ein oranges Pigment. Es besteht aus acht Isopreneinheiten und zwei endständigen Ringen. Es besitzt keine Alkohol- oder Ketogruppe [Pignolet et al. 2013] und gehört somit zur Gruppe der Carotinoide. Der Molekülaufbau ist in Abbildung 2-1 dargestellt.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-1: Chemische Struktur von β-Carotin [Spoalore et al. 2006].
Dieses Carotinoid ist das erste kommerzialisierte Produkt aus Mikroalgen überhaupt [Borowitzka 2013]. Es wird großtechnisch aus der Mikroalge Dunaliella salina gewonnen [Duffosé et al. 2005]. Diese akkumuliert bis zu 10 w/w-% β-Carotin bezogen auf das Trockengewicht [Guedes et al. 2011]. In der Alge erfüllt das Pigment Funktionen als Schutzpigment gegen hohe UV-Strahlung und als kompatibles Solut gegen hohe extrazelluläre Salzkonzentrationen [Pignolet et al. 2013]. Der Großteil des industriell produzierten β-Carotin wird jedoch über einen chemischen Syntheseweg hergestellt [Borowitzka 2013]. Im menschlichen Körper schützt das Pigment die Haut vor UV-Induzierten Zellschäden und trägt zur Prävention von akuten und chronischen Koronarerkrankungen und diverser Krebserkrankungen bei [Vilchez et al. 2011], [Duffosé et al. 2005]. Es wirkt als Radikalfänger und wird in der Leber zu Vitamin A abgebaut. Dieses wiederrum hat wichtige Funktionen in der Immunabwehr des Körpers und bei der Vorbeugung von Augenkrankheiten [Duffosé et al. 2005], [Burri 1997]. Verwendet wird β-Carotin wegen seiner starken Färbung und Ungiftigkeit als Lebensmittelfarbstoff [Duffosé et al. 2005], [Bruice 2011]. Es ist in der Bundesrepublik Deutschland (BRD) als Lebensmittelzusatzstoff zugelassen und trägt die Nummer E160a [Bundesministerium der Justiz und für Verbraucherschutz 2012]. Als solcher findet es sich in Produkten wie Butter, Käse und Jogurt. Weiterhin wird es in Pharmazeutika, Kosmetika und als Nahrungsergänzungsmittel verwendet [Duffosé et al. 2005], [Bruice 2011]. Das Marktvolumen für β-Carotin beträgt 261 Mio US $ für das Jahr 2010 [BCC Research 2011]. Der Preis pro kg beträgt dabei zwischen 300 und 1500 US $ [Borowitzka 2013].
2.1.2 Lutein
Lutein ist ein Xantophyll, welche oxygenierte Derivate der Carotinoide darstellen [Higuera-Ciapara et al. 2006]. Seine gelbe Färbung ist direkt mit seinem Molekülaufbau verknüpft. Durch die konjugierten Doppelbindungen weist Lutein Absorptionsbanden im Bereich des sichtbaren Lichtes auf [Kalariya et al. 2012]. Sein Grundaufbau ist identisch mit dem von β-Carotin, mit dem Unterschied, dass Lutein zwei Hydroxylgruppen aufweist. Diese sind jeweils an den beiden endständigen Ringen zu finden (siehe Abbildung 2-2) [Duffosé et al. 2005]. Durch die Hydroxylgruppen ist Lutein in der Lage mit Fettsäuren veresterte Formen zu bilden [Alves-Rodrigues & Shao 2004].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-2: Chemische Struktur von Lutein [Duffosé et al. 2005].
In der Natur ist Lutein in Eigelb und tierischen Fetten vorhanden [Kalariya et al. 2012]. Großtechnisch wird dieses Xantophyll aus den Blütenblättern der Blumen Tagetes erecta und Tagetes patula gewonnen. Diese weisen mit 0,3 mg∙g-1 Lutein pro Biotrockenmasse nur einen geringen Gehalt auf [Cordero et al. 2011]. Aus diesem Grund wird nach alternativen Quellen für Lutein gesucht. Verschiedene Algenspezies wie Chlorella sorokiniana (2 - 4,3 mg∙g-1 bezogen auf die Biotrockenmasse [Matsukawa et al. 2000], [Cordero et al. 2011]) und Chromochloris zofingiensis (1,7 mg∙g-1 bezogen auf die Biotrockenmasse [Del Campo et al. 2004]) sind deswegen Gegenstand der Forschung [Del Campo et al. 2000]. Lutein hat positive Auswirkungen auf die Augengesundheit und kann hier bei der Vorbeugung von degenerativen Augenkrankheiten helfen [Vilchez et al. 2011]. Beim Menschen kommt es zu einer Akkumulation von Lutein in der Retina, wo es als Filter für blaues Licht wirkt und das Auge durch seine antioxidativen Fähigkeiten vor oxidativer Beschädigung schützt [Kijlstra et al. 2012], [Alves-Rodrigues & Shao 2004]. Weiterhin hat es positive Auswirkungen auf das Immunsystem und wirkt entzündungshemmend [Kijlstra et al. 2012]. In der BRD ist Lutein als Lebensmittelzusatzstoff E161b zugelassen[Bundesministerium der Justiz und für Verbraucherschutz 2012]. Als solcher ist er in Milchprodukten, Diätnahrungsmitteln und Nahrungsergänzungsmitteln zu finden [Bundesministerium der Justiz und für Verbraucherschutz 2012], [Vilchez et al. 2011]. Für das Jahr 2010 beträgt das Marktvolumen von Lutein 233 Mio. US $ [BCC Research 2011].
2.1.3 Astaxanthin
Astaxanthin (Ax) ist ein Pigment von roter Farbe und gehört zur Familie der Xantophylle [Higuera-Ciapara et al. 2006], [Parry Nutraceuticals 2014]. Es besteht aus 40 Kohlenstoff-Atomen und weist mittelständig, wie auch β-Carotin und Lutein, eine Kohlenstoffkette mit 9 konjugierten Doppelbindungen auf [Ambati et al. 2014], [Urich 1994]. Die beiden endständigen Ringe unterscheiden sich von β-Carotin durch das Vorhandensein jeweils einer Keto- und Hydroxylgruppe [Higuera-Ciapara et al. 2006], [Ambati et al. 2014]. Die Hydroxylgruppe kann mit Fettsäuren verestert sein. In Algen liegt der Großteil des Ax als Fettsäuremonoester oder -diester vor [Ambati et al. 2014]. Ax besitzt eine Vielzahl von Isomeren. Jede Doppelbindung der Kette kann in cis- oder trans -Konfiguration vorliegen. Die cis -Isomere weisen jedoch eine geringere Stabilität auf. Somit ist das in der Natur vorherrschende Isomer das trans -Isomer [Britton 1995]. In einigen Lösungsmitteln neigt das nicht veresterte trans -Isomer jedoch dazu, die isomeren cis -Formen zu bilden [Yuan & Chen 1999]. Die veresterten Formen des Ax sind hingegen stabil [Yuan & Chen 1998]. Abgesehen von den geometrischen Isomeren kann trans -Ax noch in Form verschiedener optischer Isomere vorliegen. Hier seien die Enantiomere (3R, 3’R und 3S, 3’S) und die Meso-Form (3R, 3’S) genannt [Higuera-Ciapara et al. 2006], [Parry Nutraceuticals 2014]. Einen Überblick zu den Ax-Isomeren liefert Abbildung 2-3. Das Vorkommen der optischen Isomere ist von der Herkunft des Ax abhängig. Synthetisches Ax ist eine Mischung mit dem Verhältnis 1:2:1 der Isomere (3S, 3’S), (3R, 3’S) und (3R, 3’R) [Higuera-Ciapara et al. 2006]. Ax aus natürlichen Quellen liegt meist in der (3S, 3’S) und (3R, 3’R) Form vor [Ambati et al. 2014]. In Haematococcus pluvialis ist Ax hauptsächlich als (3S, 3’S)- trans -Ax vorhanden, wobei auch verschiedene cis -Isomere, besonders 9- cis - und 13- cis -Ax, zu finden sind [Yuan & Chen 1998].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-3: (a,b,c) Stereoisomere von Astaxanthin, (d) Beispiel eines cis -Isomers[Higuera-Ciapara et al. 2006].
Ax findet hauptsächlich als färbender Futtermittelzusatz für Aquakulturen von Lachs und Krebstieren Verwendung [Higuera-Ciapara et al. 2006], [Vilchez et al. 2011], [Borowitzka 2013]. Weiterhin wird es in der Pharma- und Nahrungsmittelindustrie als Zusatzstoff E161j verwendet, da es zahlreiche gesundheitliche Vorzüge hat. In seiner Funktion als Antioxidans (die antioxidative Effektivität wird als zehnmal höher im Vergleich zu β-Carotin angegeben Duffosé et al. 2005) kann es freie Radikale binden. Zellschäden werden somit verringert und damit das Auftreten von Krebserkrankungen reduziert [Higuera-Ciapara et al. 2006]. Des Weiteren hat Ax entzündungshemmende Eigenschaften und positive Auswirkungen auf das menschliche Immunsystem. Es beugt kardiovaskulären Erkrankungen vor, ebenso wie UV-induzierten DNA-Schäden in Hautzellen [Vilchez et al. 2011], [Higuera-Ciapara et al. 2006], [Ambati et al. 2014]. Das Ax-Marktvolumen für Aquakulturen in den USA wird mit 260 Mio US $ für das Jahr 2009 angegeben, der Preis beträgt dabei 2500 US $∙kg-1 [Vilchez et al. 2011]. Industriell wird Ax unter anderem aus H. pluvialis gewonnen. Hierauf wird in Kapitel 2.2.1 näher eingegangen.
2.2 Produktionsorganismen
2.2.1 Haematococcus pluvialis
Als Produktionsorganismen für Pigmente kommen verschiedene Mikroorganismen in Frage. Haematococcus pluvialis (H. pluvialis) ist dabei die einzige Alge, die im industriellen Maßstab bereits Verwendung findet [Grewe 2009], [Spoalore et al. 2006], [Duffosé et al. 2005]. Sie ist eine Süßwasseralge [Borowitzka 2013] und eine taxonomische Klassifizierung ist in Tabelle 2-1 aufgeführt.
Tabelle 2-1: Taxonomische Klassifizierung von H. pluvialis [Parry Nutraceuticals 2014].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Mikroalge weist zwei verschiedene Stadien auf. Unter optimalen Wachstumsbedingungen bildet sie 5 µm große, grüne Zellen, die dank ihrer zwei Flagellen mobil sind. Unter Stressexposition (hohe Lichtstärken, Nährstoffmangel, insbesondere Stickstoff und Phosphor, hohe Salzkonzentrationen und Temperaturen Ambati et al. 2014, Grewe 2009) bildet die Mikroalge rote, unbewegliche, dickwandige Aplanosporen (Siehe Abbildung 2-4) [Grewe 2009], [Parry Nutraceuticals 2014].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-4: H. pluvialis in verschiedenen Wachstumsstadien. (a) vegetative Wachstumsphase. (b) Aplanosporen Wachstumsphase. Aufnahmen mittels Lichtmikroskop (Zeis, Axiovert 40 CFL).
Die rote Färbung ist auf die Akkumulation von Ax in Lipidglobuli im Cytosol zurückzuführen [Grewe 2009]. Der Ax-Gehalt wird in der Literatur mit Werten von 0,2 - 3 w/w-% [Johnson & An 1991], [Pignolet et al. 2013], [Duffosé et al. 2005], [Richmond 2004], [Del Campo et al. 2007] der Biotrockenmasse angegeben. Einzelne Autoren geben auch höhere Werte an (bis zu 3,8 % [Ambati et al. 2014], 3 % [Pulz & Gross 2004], 8 % [Mendes-Pinto et al. 2001], jeweils bezogen auf das Trockengewicht). Der Grund für diese große Spannbreite sind unterschiedliche Kultivierungsbedingungen und die Verwendung verschiedener Stämme. Damit weist H. pluvialis den höchsten unter Mikroalgen bekannten Ax-Gehalt auf [Guedes et al. 2011]. In der Industrie wird Ax mit H. pluvialis über eine zweistufige Kultivierung gewonnen. In der ersten Phase wächst sie unter optimalen Wachstumsbedingungen in geschlossenen Photobioreaktoren zu hohen Zelldichten an vegetativen Zellen heran. In dieser Phase kommen abgeschlossene Systeme zum Einsatz, da durch das langsame Wachstum das Kontaminationsrisiko sehr groß ist. Anschließend wird, durch die Einführung von Stressfaktoren (Nährstofflimitierung und Sonnenlicht), die Aplanosporenbildung und damit die Ax-Produktion angeregt. Diese Phase findet meist in offenen Kultivierungssystemen (open ponds oder raceway ponds [Parry Nutraceuticals 2014]) statt. Anschließend folgt die Aufarbeitung der Biomasse. Diese beinhaltet den Zellaufschluss und einen Extraktionsschritt [Richmond 2004], [Grewe 2009], [Liu et al. 2014], [Duffosé et al. 2005], [Borowitzka 2013]. Als Extraktionsmethoden finden beispielsweise überkritische Extraktionen mit CO2 [Richmond 2004] oder Solvent Extraktionen mit Ethylacetat [Parry Nutraceuticals 2014] Verwendung. Das gewonnene Ax wird anschließend mit Hilfsstoffen (z.B. Antioxidantien, Stärke, Gelatine) versetzt um seine Stabilität zu erhöhen und in Form von Pulvern, Tabletten oder in pflanzlichen Ölen verkauft [Richmond 2004]. Dabei ist in diesen Produkten nicht nur freies trans -Ax enthalten, sondern auch geringe Anteile an verschiedenen cis -Isomeren, mit Fettsäuren verestertes Ax und weitere Carotinoide. Die genaue Zusammensetzung eines H. pluvialis Oleoresin Extraktes kann der nachstehenden Literatur entnommen werden [Kibbutz 1998]. Oleoresin bezeichnet dabei ein Naturstoffextrakt, das ätherische Öle und Harze enthält.
2.2.2 Chlorella sorokiniana
Chlorella sorokiniana (C. sorokiniana) ist eine unbegeiselte Grünalge [Chader et al. 2011]. Eine taxonomische Einordnung der Art ist in Tabelle 2-2 aufgeführt. Die Alge weißt eine Zellgröße von ca. 2-4 µm auf (siehe Abbildung 2-5).
Tabelle 2-2: Taxonomische Klassifizierung von Chlorella sorokiniana [AlgaeBase 2014a].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-5: vegetative Zellen von Chlorella sorokiniana [Chader et al. 2011].
C. sorokiniana weist im Vergleich zu anderen Carotinoidproduzenten ein gutes Wachstum auf. Cordero et al. berichtet, dass spezifische Wachstumsraten von µ = 0,11 h-1 erreicht werden können [Cordero et al. 2011]. Auch andere Autoren berichten von hohen spezifischen Wachstumsraten (0,14 h-1 [Li et al. 2014], 0,24 h-1 [Matsukawa et al. 2000], 0,13 h-1 [Zheng et al. 2013]). C. zofingiensis, zum Vergleich, erreicht photoautotroph spezifische Wachstumsraten von 0,04 h-1 [Del Campo et al. 2000], [Del Campo et al. 2004]. Die Biomassekonzentrationen, die über photoautotrophes Wachstum erreicht werden, liegen in der Literatur bei 6 - 8 g∙L-1 [Cordero et al. 2011]. Es ist aber auch möglich C. sorokiniana heterotroph oder mixotroph zu kultivieren. Hierzu werden mixotrophe Fermentationen (Minimalmedium mit 20 g∙L-1 Glucose) angegeben, welche Biomassekonzentrationen von 11,2 g∙L-1 erreichen. Die spezifische Wachstumsrate beträgt dabei 0,13 h-1 [Zheng et al. 2013]. An Carotinoiden und Xantophyllen enthält C. sorokiniana größere Mengen an Lutein. Weitere Carotinoide sind ebenfalls enthalten, jedoch bildet die Mikroalge kein Ax [Matsukawa et al. 2000]. Der Luteingehalt wird mit 2 - 4,3 mg∙g-1 bezogen auf die Biotrockenmasse angegeben [Matsukawa et al. 2000], [Cordero et al. 2011], abhängig von den Kultivierungsbedingungen und dem Stamm. Auch bei C. sorokiniana kann die Luteinproduktion durch Stressfaktoren (hohe Lichtstärken, hohe Temperaturen, Stickstoffmangel) gesteigert werden. Weiterhin erhöht eine mixotrophe Kulturführung mit Acetat den endständigen Luteingehalt [Cordero et al. 2011]. Somit stellt C. sorokiniana eine alternative Luteinquelle im Vergleich zu den etablierten Luteinproduzenten Tagetes erecta und Tagetes patula dar.
2.2.3 Chromochloris zofingiensis
Chromochloris zofingiensis (C. zofingiensis) ist eine Grünalge, die in Süßwasserhabitaten zu finden ist. Eine taxonomische Klassifizierung ist in Tabelle 2-3 dargestellt. Die Gattung wird in einigen Berichten auch Muriella, Mychonastes oder Chlorella zugerechnet. Dies deutet eine gewisse evolutionäre Ferne zur Gattung der Chlorella an [Liu et al. 2014].
Tabelle 2-3: Taxonomische Klassifizierung von C. zofingiensis [AlgaeBase 2014b].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-6: C. zofingiensis unter optimalen (A) und stress (B) Bedingungen. Länge des Maßstabbalkens 5 µm [Liu et al. 2014].
Die runden Zellen weisen keine Begeiselung auf und haben einen Durchmesser von 2 – 15 µm (siehe Abbildung 2-6). Unter optimalen Wachstumsbedingungen bildet C. zofingiensis einen großen Chloroplast aus. Wird die Alge jedoch Stressfaktoren ausgesetzt, bildet sich dieser zurück und die Zelle beginnt Lipidkörper aufzubauen in denen Carotinoide akkumuliert werden [Liu et al. 2014]. Hierbei sind Ax und Lutein die mengenmäßig bedeutendsten Pigmente [Del Campo et al. 2004]. In der Literatur sind für Lutein und Ax jeweils endständige Werte von 1,7 mg∙g-1 bezogen auf die Biotrockenmasse angegeben [Del Campo et al. 2004]. Eine Übersicht über weitere erzielte Ax-Gehalte gibt Liu et al. [Liu et al. 2014]. Die Kultivierung der Alge kann photoautotroph, heterotroph und mixotroph stattfinden. Photoautotroph wird über spezifische Wachstumsraten von 0,04 h-1 und Biomassekonzentrationen von 7 g∙L-1 berichtet [Del Campo et al. 2000], [Del Campo et al. 2004]. Heterotroph mit Glucose als Substrat werden spezifische Wachstumsraten von 0,03 h-1 und Biotrockenmassekonzentrationen von bis zu 10 g∙L-1 erreicht [Ip & Chen 2005]. Mixotroph mit Glucose als Substrat wird von spezifischen Wachstumsraten von 0,04 h-1, Substratausbeuten von 0,6 g∙g-1 und endständige Biotrockenmassekonzentrationen von 3,4 g∙L-1 berichtet [Ip et al. 2004]. Auch für C. zofingiensis kann die Akkumulation von Carotinoiden über den gezielten Einsatz von Stressfaktoren verstärkt werden. Hier seien ein hoher NaCl-Gehalt (35 - 70 mM), geringe NaNO3-Konzantration (20 - 30 mM), hohe Temperatur bzw. Lichtstärken genannt [Del Campo et al. 2000], [Liu et al. 2014].
2.3 Zellaufschluss
In Mikroalgen liegen die meisten Wertprodukte innerhalb der Zelle vor [Chisti & Moo-Young 1986]. Um diese zugänglich zu machen, ist es nötig die Zellhülle zu zerstören [Chisti & Moo-Young 1986], [Harrison 2011]. Der Widerstand den die Algenzelle dieser Beschädigung entgegenbringt, ist von der Struktur der Zellwand abhängig. Die Zellwand der meisten Algen ist aus Glycoproteinen oder Polysacchariden oder einer Kombination beider aufgebaut [Harrison 2011]. Dabei ist Cellulose das häufigste Polysaccharid. Der Grad der Kristallinität der Cellulose ist dabei einer der entscheidenden Einflussfaktoren auf die Stabilität der Zellwand [Harrison 2011]. Zum Aufschluss mikrobieller Zellen ist eine Fülle von Verfahren bekannt. Einen Überblick liefert Abbildung 2-7.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 2-7: Klassifizierung verschiedener Zellaufschlussmöglichkeiten, verändert nach [Harrison 2011].
Die Methoden unterscheiden sich durch ihren Maßstab, Kosten und die Denaturierung von Wertprodukten. Im Folgenden soll eine Auswahl an verschiedenen Zellaufschlüssen beschrieben werden.
2.3.1 Enzymatischer Zellaufschluss
Enzymatischer Zellaufschluss beinhaltet alle Methoden die mithilfe von Enzymen mikrobielle Zellen lysieren. Zum Verdau von H. pluvialis Zellwänden beispielsweise, kann Protease K und Driselase verwendet werden [Mendes-Pinto et al. 2001]. Vorteile dieser Zellaufschlusstechnik liegen in den milden Aufschlussbedingungen, durch die es zu keiner Zerstörung der Wertprodukte aus der Zelle kommt[Harrison 1991]. Des Weiteren ist diese Methode spezifisch für eine Zellwandstruktur, wodurch nur die mikrobielle Zellart, die diese aufweist, aufgeschlossen wird [Mendes-Pinto et al. 2001], [Harrison 1991]. Die im Allgemeinen hohen Kosten und der Verlust des Enzyms im umgebenden Medium beschränken diese Vorgehensweise auf den Labormaßstab. Großtechnisch findet es keine Verwendung [Chisti & Moo-Young 1986], [Harrison 2011].
2.3.2 Chemischer Zellaufschluss
Die chemischen Reagenzien, die zum Zellaufschluss verwendet werden können, sind von der Struktur abhängig, die zerstört oder beschädigt werden muss. Typische Stoffe die Verwendung finden können sind pH-Extreme, hier vor allem Laugen, Lösungsmittel, Reduktionsmittel und chaotrope Reagenzien [Harrison 2011], [Chisti & Moo-Young 1986]. Als Detergenz können beispielsweise Natriumlaurylsulfat oder andere anionische Tenside zum Zellaufschluss verwendet werden [Bansal-Mutalik & Gaikar 2003]. Probleme können sich hierbei über die Verunreinigung der Wertprodukte mit den Reagenzien ergeben, oder durch die Beschädigung oder Denaturierung von Zielprodukten [Richmond 2004], [Chisti & Moo-Young 1986]. Hier seien die Denaturierung von Proteinen durch Lösungsmittel [Harrison 2011] oder die Umwandlung von Ax zu Astacen unter alkalischen Bedingungen [Johnson & An 1991] genannt. Für H. pluvialis haben Mendes-Pinto et al. chemische Zellaufschlussmethoden durchgeführt, unter anderem Behandlung mit HCl und NaOH [Mendes-Pinto et al. 2001]. Weiterhin wird über die Zerstörung der Cytoplasmamenbran von Bakterienzellen durch Aceton, Ethylacetat, Toluol und Chloroform berichtet [Harrison 1991]. Wie der enzymatische Zellaufschluss hat sich der chemische Zellaufschluss noch nicht im industriellen Maßstab etabliert und findet hauptsächlich im Labor Verwendung [Harrison 2011]
2.3.3 Mechanischer Zellaufschluss
Methoden des mechanischen Zellaufschlusses umfassen alle Verfahren, in denen Scherkräfte aufgebracht werden, um die Zellwand zu beschädigen bzw. zu zerstören [Chisti & Moo-Young 1986]. Dabei können die Scherkräfte in einer Suspension erzeugt werden, oder im Trockenen. Es ist also möglich sowohl Zellsuspensionen als auch Biotrockenmasse mechanisch aufzuschließen [Harrison 2011]. Die am weitesten verbreiteten Methoden dieser Klasse sind Kugelmühlen (Scherkräfte im Trockenen) und Hochdruckhomogenisatoren (Scherkräfte in Suspension) [Chmiel 2011]. Diese Verfahren sind auch im großtechnischen Maßstab bereits etabliert [Chisti & Moo-Young 1986], [Harrison 2011], [Chmiel 2011].
Das Funktionsprinzip der Hochdruckhomogenisation ist, die Zellsuspension in einem Hohlzylinder auf hohen Druck zu bringen. Anschließend wird die Suspension durch ein Ventil entspannt und prallt darauffolgend auf einen Stator-Ring. Die schnelle Veränderung der Druckverhältnisse, sowie der Aufprall der Zellen auf den Stator-Ring und eventuell auftretende Kavitationen zerstören die Zellwand sehr effektiv [Chisti & Moo-Young 1986], [Chmiel 2011], [Harrison 2011]. Einflussfaktoren hierbei sind der Druck in der Homogenisatorzelle, und die Geometrie des Ventiles [Chisti & Moo-Young 1986]. Erwähnenswert ist noch, dass bei steigendem Druck der Einfluss der Biomassekonzentration auf den Aufschluss abnimmt [Harrison 1991]. Ein Problem dieser Technik ist, dass es durch die hohe Dissipation von Energie zu einer Erwärmung der Probe kommt. Es muss somit in bestimmten Fällen über eine Kühlung der Probe während des Prozesses oder vor dem Prozess nachgedacht werden. Für den Aufschluss von Hefezellen konnte jedoch kein Verlust von Enzymaktivität festgestellt werden [Harrison 1991], so dass davon ausgegangen werden kann, dass es bei passender Temperierung zu keiner Denaturierung und Deaktivierung von intrazellulären Produkten kommt. Einen Hochdruckhomogenisator im Labormaßstab, der als Batch -Prozess betrieben wird, stellt die French Press dar [Harrison 2011].
In einer Kugelmühle wird die getrocknete Biomasse in die Mahltrommel eingebracht. Dort werden die Mahlkörper (meist Stahl oder Glaskugeln) durch Reibungs- und Trägheitskräfte auf eine gewisse Höhe mitgenommen und prallen anschließend auf das zu zerkleinernde Gut [Chmiel 2011]. Dabei werden Scherkräfte auf die Zellen übertragen und durch die mechanische Beanspruchung die Zellhülle aufgebrochen. Der Zellaufschluss wird hierbei von sehr vielen Faktoren beeinflusst. Hier seien mit der geometrischen Beschaffenheit, Dichte und Material der Mahlkörper, Frequenz der Stöße, Verweilzeit der mikrobiellen Zellen, Beschaffenheit und Durchmesser derselben, nur die wichtigsten genannt. Ein Überblick über die gesamten Parameter wird von Harrison gegeben [Harrison 1991]. Der Tissue Lyser, der im Rahmen dieser Arbeit Verwendung findet (siehe Kapitel 4.7.2), stellt eine Kugelmühle im Labormaßstab dar.
2.4 Extraktion
Die Extraktion ist ein Prozess in dem zwei Phasen miteinander in Kontakt gebracht werden, mit dem Ziel einen gelösten Stoff oder Partikel von der einen in die andere Phase zu transferieren. Die beiden Phasen dürfen möglichst wenig mischbar sein [Chmiel 2011]. Es ist möglich, dass anstatt zweier nicht mischbarer flüssiger Phasen ein Feststoff und eine flüssige oder überkritische Phase verwendet werden. Hierbei geht das Wertprodukt aus der festen Phase in Lösung [Harrison 2003]. Ziel der Extraktion ist es, aus einem meist komplexen Stoffgemisch selektiv einen Stoff herauszulösen [Harrison 2003], [Chmiel 2011].
In der Biotechnik werden meist organische Lösungsmittel in einer Solventextraktion eingesetzt. Für die Extraktion von Proteinen sind diese jedoch nicht geeignet, da diese durch organische Lösungsmittel deaktiviert werden können [Harrison 2003], [Chmiel 2011]. Hier kann eine wässrige Zweiphasenextraktion zum Einsatz kommen [Harrison 2003]. Eine weitere Extraktionsmethode die in der Biotechnik immer häufiger Verwendung findet, ist die Extraktion mit überkritischen Gasen. Hier wird meist CO2 verwendet, da es nach der Extraktion keinerlei Rückstände im Extrakt hinterlässt [Chmiel 2011], [Herrero et al. 2006]. Abschließend sei noch die Soxleth-Extraktion genannt. Bei dieser Extraktionsmethode wird der zu extrahierende Feststoff kontinuierlich mit frischem, kondensiertem Lösungsmittel betropft. Das beladene Lösungsmittel läuft anschließend über in einen Auffangbehälter, indem es wieder verdampft wird. Das Lösungsmittel wird somit im Kreis geführt und die extrahierten Stoffe im Auffangbehälter gesammelt [Luque de Castro & Garcı́a-Ayuso 1998].
Eine neue Extraktionsmethode die im Labormaßstab zum Einsatz kommt ist die beschleunigte Lösungsmittelextraktion (accelerated solvent extraction, oder pressurised fluid extraction). Hierbei werden die Extraktionsmittel auf hohen Druck gebracht und gehalten. Der Vorteil dabei ist, dass Lösungsmittel auf Temperaturen über deren atmosphärischen Siedepunkt erhitzt werden können [Mustafa et al. 2012]. Weiterhin wird das Fluid in die Poren der Probe gedrückt, wodurch es zu einer besseren Benetzung und somit einer größeren Stoffaustauschfläche kommt [Richter et al. 1996]. Insgesamt stellt die pressurised fluid extraction eine sehr effektive Extraktionsmethode dar [Mustafa et al. 2012].
2.4.1 Extraktionsmittel in der Lebensmitteltechnik
Die Wahl des richtigen Lösungsmittels ist für die Auslegung des Extraktionsprozesses von größter Wichtigkeit. Neben einer hohen Selektivität sowie großer Kapazität für den zu extrahierenden Stoff muss ebenfalls beachtet werden, dass Lösungsmittel und Wertprodukt leicht trennbar sein müssen. Dies ist z.B. gewährleistet, falls das Extraktionsmittel einen niedrigen Siedepunkt hat und somit leicht abgedampft werden kann. Weiterhin sind auch noch Eigenschaften zu beachten, die die Betriebs- und Handhabungssicherheit betreffen, wie die Toxizität und eine geringe Brennbarkeit [Chmiel 2011]. Vor dem Hintergrund des Einsatzes von Carotinoide als Lebensmittel bzw. als Lebensmittelzusatzstoff existieren weitere Reglementierungen [Vilchez et al. 2011]. Hierbei ist festgelegt, welche Stoffe als Extraktionsmittel benutzt werden dürfen. Die Regelung der Extraktionsmittel, die in der BRD zur Verarbeitung und Herstellung von Lebensmitteln zugelassen sind, erfolgt in der Technischen Hilfsstoffverordnung [Bundesministerium der Justiz und für Verbraucherschutz 1991]. Lebensmittelzusatzstoffe sind jedoch explizit von dieser Verordnung ausgenommen [Bundesministerium der Justiz und für Verbraucherschutz 1991]. Die Extraktionsmittel die in der Europäischen Union (EU) zur Herstellung von diesen zugelassen sind, finden sich in der Verordnung (EU) 231/2012 [Die europäische Kommission 2012]. Vorhandene Löslichkeitsdaten zu den Pigmenten Ax, Lutein und β-Carotin umfassen somit hauptsächlich die dort aufgeführten Lösungsmittel. Eine Übersicht über die Löslichkeitsdaten einiger ausgewählter Lösungsmittel ist in Tabelle 2-4 aufgeführt.
Tabelle 2-4: Löslichkeitsdaten ausgewählter Lösungsmittel 1)[Johnson & An 1991] 2)[Craft & Soares 1992].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
3 Zielstellung
Ziel dieser Arbeit ist es den Einfluss verschiedener Zellaufschlussmethoden und Extraktionsparameter auf den Pigmentgehalt ausgewählter Mikroalgenspezies zu ermitteln. Bevor interessante Mikroalgenspezies hinsichtlich deren Carotinoidgehalt untersucht werden, ist es zunächst erforderlich, einen Aufarbeitungsprozess sowie eine qualitative und quantitative Analytikmethode zu etablieren. Hierbei soll der Einfluss von bis zu sechs verschiedenen Zellaufschlussmethoden auf den Carotinoidgehalt verschiedener Algen untersucht werden. Die qualitative und quantitative Bestimmung der Pigmentgehalte erfolgt hierbei mittels HPLC.
Des Weiteren soll die zum jetzigen Zeitpunkt verwendete Extraktionsmethode mittels ASE optimiert werden. Hierbei sollen unter identischen Zellaufschlussbedingungen verschiedene Lösungsmittel bzw. Lösungsmittelgemische verwendet werden. Des Weiteren konnte in Vorarbeiten zu dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein Einfluss der Extraktionstemperatur vorliegt (20, 40, 60°C). Demzufolge soll der Einfluss höherer Temperaturen näher untersucht werden. Neben dem Parameter Temperatur stellen die Extraktionsdauer sowie die Zyklenzahl weitere wichtige Parameter dar, die näher untersucht werden sollen. Abschließend soll ein Vergleich zwischen einer manuell durchgeführten Extraktion und der automatisierten Extraktion durchgeführt werden.
4 Material und Methoden
4.1 Material
In den Kapiteln 4.1.1 bis 4.1.3 folgt eine Abhandlung der verwendeten Laborgeräte, Chemikalien und Verbrauchsgegenstände.
4.1.1 Laborgeräte
Tabelle 4-1: Übersicht der Laborgeräte.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.1.2 Chemikalien
Tabelle 4-2: Verwendete Chemikalien.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.1.3 Verbrauchsmaterialien
Tabelle 4-3: Zusammenfassung der Verbrauchsmaterialien.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.2 Verwendete Mikroalgen
Im Rahmen dieser Arbeit werden drei verschiedene Mikroalgen aus der Sammlung von Algenkulturen Göttingen (SAG) verwendet. Dabei handelt es sich um:
Haematococcus pluvialis (H. pluvialis), Stammbezeichnung: SAG-34-1b
Chlorella sorokiniana (C. sorokiniana), Stammbezeichnung: SAG-211-8k
Chromochloris zofingiensis (C. zofingiensis) , Stammbezeichnung: SAG-211-14
4.3 Verwendete Kultivierungsmedien
Für die Kultivierung der Mikroalgen kommen zwei verschiedene Medien zum Einsatz. Die Zusammensetzung des Arnon-Medium ist in Tabelle 4-4 enthalten.
Tabelle 4-4: Zusammensetzung des Arnon Medium [Del Campo et al. 2004].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Zusammensetzung des M1-Medium kann Tabelle 4-5 entnommen werden.
Tabelle 4-5: Medienzusammensetzung M1-Medium + 1 g ∙ L-1 Bacto Tryptone.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
4.4 Kultivierung der verwendeten Mikroalgen
4.4.1 Vorkulturführung
Die Vorkulturführung erfolgt in Erlenmeyerkolben im CO2-Inkubator (Infors-HAT, Multitron) bei 3 v/v-% CO2, 25 °C, 100 rpm und ca. 40 µmol∙m-2∙s-1. Die hierbei verwendeten Kultivierungsmedien können Kapitel 4.3 entnommen werden. Nach Erreichen der stationären Phase werden die Kulturen in neues Medium überführt.
4.4.2 PSM-Kultivierung
Innerhalb der Arbeit erfolgen Kultivierungen in den am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik Erlangen verfügbaren 1 L Photobioreaktor- Screening -Modulen (PSMen). Hierbei handelt es sich um dampfsterilisierbare Photobioreaktoren, bei denen Kultivierungen unter vergleichbaren sowie monoseptischen Bedingungen durchgeführt werden können. Der allgemeine Aufbau der PSMe ist nachfolgend beschrieben.
Aufbau
Der Hauptkörper des Reaktors ist ein Hohlzylinder aus Borosilikatglas ( Innen 50 mm, Borosilikat 3.3, QVF CE 0035 der Firma QVF). Am Kopf und am Fuß des Reaktors wird dieser durch ein Flanschsystem und jeweils einen PTFE-Dichtring abgedichtet. An der Bodenplatte ist mittig eine Bohrung für die Begasung und eine Kühlschlaufe angebracht. Am Kopf des Reaktors finden sich Öffnungen für die Abluft und Probenahme. Weiterhin sind Bohrungen für zusätzliche Sensoren, Antischaummittelzugabe und Substratzugabe bzw. für das Inokulum vorhanden. Die Einstellung des Volumenstroms für die mit CO2 angereicherte Druckluft geschieht je PSM über ein Rotameter. Der CO2-Gehalt wird über einen CO2-Analysator (Blue Sense Gas Sensor GmbH, BCP-CO2-Analysator) gemessen und gegebenenfalls nachgeregelt. Eine schematische Darstellung eines PSMes ist in Abbildung 4-1 zu sehen.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abbildung 4-1: Schematische Darstellung eines PSMes [Nauman 2009]. Abbildung verändert nach [Baer 2013].
Die PSMe sind stehend in einem Schrank angebracht. Dieser ist durch vertikale Bretter in einzelne Segmente unterteilt. In jedem Segment wird ein PSM durch vier Leuchtstoffröhren (Osram, Lumilux Cool White L 18 W / 84) extern beleuchtet (siehe Abbildung 4-2).
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