Este trabajo se propone explorar parte de una posible etiología común entre las anomalías del epitelio seminífero y tumores testiculares.
SWI/SNF es un complejo remodelador del nucleosoma que interviene en mecanismos de regulación epigenética y expresión génica. Está relacionado con una plétora de funciones celulares que protegen la aparición del cáncer, interviene en procesos de control de crecimiento celular, reparación del DNA, desarrollo, diferenciación y gametogénesis.
Los resultados del estudio de biopsias testiculares y orquiectomías relacionados a la expresión de algunas subunidades del complejo SWI/SNF en epitelio seminífero, durante la espermatogenesis y en tumores de células germinales, muestran claros patrones de reactividad inmunohistoquímicas entre los distintos casos clínicos. Niveles bajo de BRM/SMARCA 2 parecen ser típicos en células germinales de hombre oligoastenospermicos, en tubulos seminíferos preservados al borde de lesiones tumorales y en células de la masa tumoral. Además, los bajos niveles de tinción IQH de BRM en biopsia de pacientes subfertilies se asocian a positividad para marcadores de IGCN (Neoplasia Intratubulares de las Celulas Germinales), como PLAP (placenta fostatasa alcalina).
Resumen
Este trabajo se propone explorar parte de una posible etiología común entre las anomalías del epitelio seminífero y tumores testiculares.
SWI/SNF es un complejo remodelador del nucleosoma que interviene en mecanismos de regulación epigenética y expresión génica. Está relacionado con una plétora de funciones celulares que protegen la aparición del cáncer, interviene en procesos de control de crecimiento celular, reparación del DNA, desarrollo, diferenciación y gametogénesis.
Los resultados del estudio de biopsias testiculares y orquiectomías relacionados a la expresión de algunas subunidades del complejo SWI/SNF en epitelio seminífero, durante la espermatogenesis y en tumores de células germinales, muestran claros patrones de reactividad inmunohistoquímicas entre los distintos casos clínicos. Niveles bajo de BRM/SMARCA 2 parecen ser típicos en células germinales de hombre oligoastenospermicos, en tubulos seminíferos preservados al borde de lesiones tumorales y en células de la masa tumoral. Además, los bajos niveles de tinción IQH de BRM en biopsia de pacientes subfertilies se asocian a positividad para marcadores de IGCN (Neoplasia Intratubulares de las Celulas Germinales), como PLAP (placenta fostatasa alcalina).
Palabras claves: Semínoma, SWI/SNF Chromatin Remodeling Complex, Neoplasias de las Células Germinales, Espermatogénesis, Infertilidad Masculina, Inmunohistoquímica.
I. SWI/SNF: cáncer, espérmatogenesis y seminoma
1.1 Introducción
La espermatogénesis es un proceso complejo que requiere una regulación espacio-temporal de la expresión génica, recombinación meiótica y reparación programada del ADN. Estos procesos implican mecanismos de regulación epigenética que abarcan entre otros, modificaciones de la estructura de la cromatina y la remoción de las histonas necesarios para la transcripción del DNA. Recientemente se ha ido profundizando el estudio de las proteínas del complejo SWI/SNF en la espermatogénesis. En el human protein atlas (www.proteinatrals.org) la comparación de la expresión en diferentes tejidos de BRM (SMARCA2), BRG1 (BAF190), ARID2 (SMARC4) y BRD7 (BP75), muestran los niveles más altos en el epitelio seminífero.
BRM en ratón se detecta especialmente en espermatogonias y durante la diferenciación de las espermátides, mientras aumentos de BRG1 se presentan tempranamente durante la primera división meiótica que tiene lugar en células en estadio de espermatocito primario. La deleción especifica de Brg1 en las células de la línea germinal de ratón, resulta en defectos críticos de la espermatogénesis [1]. Otro estudio, también confirma el mismo rol fundamental para BRG1 en las células de túbulo seminífero de ratón [2].
Distintos niveles de BRD7 se detectan a lo largo de la espermatogénesis y su deficiencia lleva a una incompleta maduración de las espermátida en ratón [3].
En los ultimos años, gracias a las nuevas técnicas de secuenciación, diferentes estudios han reportado alta frecuencia de mutaciones en genes que codifican las subunidades de SWI/SNF (20% del total de los tumores) en diferentes tipos de cáncer. Aquellos con tasa más alta de mutación en el complejo SWI/SNF es el cáncer ovárico de células claras (75%), carcinoma renal de las células claras (57%), carcinoma hepatocelular (40%), cáncer gástrico (26%) [4]. Otro estudio evidencia una alta incidencia de mutaciones de BRG1 inactivantes en el 25% de 59 casos de cáncer de pulmón [5]. El 30% de ratones heterozigotos knockouts por SNF5 (BAF47, SMARCB1, INI1) presenta linfoma o tumor rabdoide [6]. Mientras el 100% de homozigotos knockouts SNF5 desarrollan el tumor [7]. Estos datos son acordes con la evidencia que el gen SNF5 es bialélicamente inactivado en tumores rabdoides somáticos y de la línea germinal, y en otros casos de tumores pediátricos [8]. La pérdida de la expresión de SNF5 lleva a la formación de complejos aberrantes de remodelación del nueclosoma [9].
Existe una fuerte evidencia de la conexión entre BRM, ARID2 y cáncer [10-12]. Aumento en los niveles de BRG1 y disminución de BRM han sido publicadas con IHQ – semicuantitativa en cáncer de próstata, comparando los niveles entre tejido sano y tumoral [13].
La investigación en este marco oncológico, con SWI/SNF como genes targets, forma actualmente un amplio campo de investigación. En las últimas décadas, algunas publicaciones han mostrado funciones esenciales de SWI/SNF en la espermatogénesis, mientras que datos que emergen de algunos estudios epidemiológicos, evidencian un aumento en el riesgo a desarrollar tumores testiculares de las células germinales (TGCT) en pacientes estériles. Otro estudio, sugiere un mecanismo común para ambas patologías involucrando en definir el plan de división de las espermatogonias durante la proliferación celular en las primeras etapas de la espérmatogenesis [14].
No se han encontrado estudios que relacionen defectos en la expresión de SWI/SNF con tumores de testículo y anomalías de la espermatogénesis. En materia de cáncer del aparato reproductor masculino algunos estudios describen mutaciones de SWI/SNF en cáncer de próstata [15]
1.2 Funciones y estructura de SWI/SNF
Las células eucariotas requieren mecanismos para compactar los casi dos metros de DNA, que contiene todo el genoma necesario para la vida, dentro de un volumen muy pequeño (2x10 um3). Este nivel de organización se alcanza acoplando el DNA con las histonas para formar la cromatina. Esta última está compuesta por unidades llamadas nucleosomas que consisten en 146 pares de bases de doble cadena envuelta alrededor de un octámero de histonas. Los nucleosomas a lo largo de la cromatina pueden empacarse estrechamente el uno contra el otro para permitir una mayor compactación dependiendo del estado en que se encuentra la célula, dando lugar a heterocromatina, eucromatina y cromosomas. Este mecanismo de compactación crea una barrera física que impide la transcripción, replicación, recombinación y reparación bloqueando el acceso de las maquinarias enzimáticas necesarias para tales acciones. La estructura más compacta (eucromatina) necesita relajarse de manera gen-específica para permitir el acceso a estos sistemas y otros mecanismos biomoleculares.
SWI/SNF es un macrocomplejo enzimático remodelador del nucleosoma, una maquinaria involucrada en mecanismos de regulación epigenética. Evolutivamente conservado en eucariotas, usa como fuente de energía la hidrolisis del ATP. En los mamíferos está relacionado con varios procesos biológicos como el desplazamiento y la escisión de las histonas en la eucromatina y las formaciones de puentes que lleguen a los complejos de transcripción, modula la compactación de la cromatina y la accesibilidad de las maquinarias de transcripción génica, contribuyendo a la organización fisicoquímica del material genético y al control de expresión del genoma. Favorece el reclutamiento de factores de reparación del daño del DNA, así como la reparación programada de DNA necesaria durante los eventos de crossing-over durante la profase uno de la meiosis [16]. Participa en la transcripción de genes que favorecen la proliferación celular, la diferenciación y el desarrollo embrionario [18-21].
El complejo comprende 10-15 proteínas unidas entre ellas con distintas asociaciones. Los subtipos de SWI/SNF adoptados como modelos, se denominan comúnmente en la literatura como BAF A, BAF B, PBAF fig. En humanos se conocen dos subunidades catalíticas helicasas/ATPasicas: BRG1 (también SMARCA4) o BRM (también SMARCA2). Además, de subunidades que confieren especificidad de dominio de acción: ARID1A y ARID1B, que se encuentran en el “BAF” complex (BRG1 o BRM associate factors) y pueden estar asociadas con ambas subunidades enzimáticas. Mientras otras subunidades de especificidad, PBRM1 junto a ARID2 (BAF 200) y BRD7, se encuentran en el PBAF complex (polybromo associated factors) asociadas solo a BRG1. Por último, hay algunas otras proteínas accesorias.
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Hohmann, Anja F. et al.
Trends in Genetics, Volume 30, Issue 8, 356 - 363
Fig. 1. organization of the human BAF and PBAF complexes. Pictures show the homologues ATPase catalytic subunit BRG1/BRM in the posibles associationw with DNA binding protein (in red and green). PBAF organization include the exlusive subunits PBRM1 (Polybromo 1, BRG1 Asociated Factor), ARID2 (AT-rich interactive domain-containing protein 2) and BRD7 (Bromodomain-containing protein 7) associated to BRG1. BAF A, include ARID1A and PAF B, include ARID2B and the catalyc subunit is BRG1 or BRM.
SWI/SNF funciona como activador/regulador transcripcional de un amplio set de genes. Microarray de expresión han mostrado que la reactivación de BRG1 en células cancerígenas (H522 NSCLC cells line), induce cambios en la expresión de una amplia parte del genoma [22].
BRG1 presenta un bromodominio que reconoce residuos de lisina acetilados en el extremo N-terminal de las histonas realizando su función en mecanismos epigenéticos. De esta manera SWI/SNF presenta una especificidad dinámica para el reconocimiento del DNA, que depende del estado fisiológico de la célula.
Aunque SWI/SNF presenta un importante papel en la regulación de la trascripción génica, este podría no ser el único mecanismo que contribuye en la carcinogénesis. Interacciones físicas directas han sido reportadas entre SWI/SNF y proteínas que tienen importantes acciones en el cáncer como RB, LKB1/STK11, bCatenina, SMAD2, SMAD3 BRCA1, CMYC, MLL, CFOS [22].
El complejo de remodelación del nucleosoma está implicado en la reparación del DNA: Bajo inducción de daños del DNA debidos por radiaciones ionizantes, se requiere BRG1 para la fosforilación de la variante histónica H2AFX que provoca la cascada de reclutamiento de las proteínas reparadoras, sugiriendo que SWI/SNF juega un papel en la reparación del DNA estrés-inducida [23].
Otras funciones en la reparación programada del DNA, como en el crossingover durante la meiosis, han sido objeto de estudio. Ablaciones específicas de BRG1 en la línea germinal en ratones producen defectos críticos de la espermatogénesis. En estos modelos, se ha demostrado como la espermatogénesis se detiene en etapa de espermatocitos primarios, incapaces de superar la primera profase meiótica con consiguiente apoptosis, presumiblemente por sistemas de control de la reparación del DNA y del ciclo celular [24].
1.3 SWI/SNF y espermatogénesis
La espermatogénesis es un proceso complejo que requiere una regulación espacio-temporal de la expresión génica, recombinación meiótica y reparación programada del ADN. Estos procesos implican una remodelación de la estructura de la cromatina. La compleja naturaleza de tal proceso requiere un preciso control de transcripción y recombinación que a la vez inducen modificaciones en la estructura de la cromatina. Así que en los espermatocitos en leptoteno, en los locus de recombinación meiótica, la apertura de la cromatina es necesaria para que la SPO11 endonucleasa acceda al DNA e introduzca rupturas dobles de cadena (DBSs). Sucesivamente la variante histónica de H2A, γH2A, en proximidad de las dobles rupturas, se fosforila en el residuo 139 de serina. Tal acción favorece la respuesta de reparación del DNA. En los espermatocitos en paquiteno, γH2A desaparece de los autosomas mientras persiste en los cromosomas sexuales, reprimiendo su transcripción [1,2].
El complejo sustituye y asocia las distintas subunidades según la función requerida. Este se refleja en distintos niveles de expresión proteica detectable en un especifico núcleo de la célula germinativa.
Tres estudios [1-3], describen la expresión y la consecuencia de la pérdida de BRM BRG1 y BRD7 en el proceso de espermatogénesis (fig.2). Expresión de BRM en ratones, no se detecta a partir del estadio IX (en paquiteno) y no persiste después del estadio VIII (espermátides redonda postmeiótica), moderados niveles están presentes en células de Sertoli. BRM aparece postmeióticamente a través la comparación con marcadores de ruptura de doble cadena de DNA (anticuerpo anti-γH2A), acción necesaria para el intercambio de segmentos de DNA durante el crossingover. BRM -/- en ratones producen embriones viables y los adultos son fértiles, mientras BRG1 KO no produce embriones viables y la deleción específica en la línea germinal provoca detención de la espermatogénesis en fase premeiotica. La expresión de BRG1 se hace visible en espermatocitos en leptoteno y aumenta en paquiteno, en correspondencia con la formación del complejo sinaptotémico (SYCP3).
BRD7 se expresa de forma importante en testículo (rtPCR y IHC, datos desde “The Human Protein Atlas. En testículos de ratones adultos, la inmunotinción de BRD7 se observa en núcleos de espermatocitos en paquiteno desde el estado II al X, en espermatocitos en diploteno en estadio XI, en espermatocitos segundarios (estadio XII) y en espermátida redondas (step 1-8) y niveles bajos o ausentes en células de Sertoli [8]. No se han observado niveles de IHQ en espermatogonias, espermatocitos en leptoteno o en zigoteno y en espermátida elongantes.
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Author’s own work
Fig. 2. Knockout of specific SWI/SNF subunits prevent the spermatogenesis progress at specifics points. Brg1 KO lock spermatogenesis in the early first meiosis in primary spermatocyte, Brd7 in the spermatids maturation. Brm KO produce viable gametes.
1.4 SWI/SNF y cáncer
El interés hacia SWI/SNF ha empezado a crecer cuando el gen SNF5 (también llamado SMARCB1, INI1, BAF47), se ha encontrado desactivado en tumores de tipo rabdoides (MRT) llevando a ulteriores estudios. Cabe destacar, que en tumores rabdoides mutaciones en snf5 dificilmente se asocian a otras, por lo tanto se pueden considerar mutaciones drivers en este tipo de tumores [25]. SNF5 asegura la integridad de varios BAF-complex y por lo tanto sus funciones en la regulación de la expresión génica [26].
En una revisión analizada, se sondea el espectro de mutaciones de SWI/SNF resultante de 24 estudios de exomas distribuidos entre 18 diferentes tipos de cánceres sobre un total de 669 pacientes. Frecuentes mutaciones en estos genes están presentes en diferentes tumores y en combinación con otras como aquellas en el supresor tumoral TP53, muy frecuentes en varios cánceres. Aquellos con la tasa más alta de mutaciones en el complejo SWI/SNF son el “ovárico de células claras" (75%), carcinoma renal de las células claras (57%), carcinoma hepatocelular (40%), cáncer gástrico (26%) [25]. Otro estudio reporta una alta incidencia de mutaciones en brg 1 inactivantes en un cuarto de 59 canceres de pulmón [5].
Las mutaciones ocurren de forma preponderante en la subunidad enzimática BRG1 (SMARCA4) y en otras tres subunidades de dominio AND-ligando-específico [27], implicando la perdida de actividad del complejo que podría contribuir a la carcinogénesis. Sin embargo, la asociación de las mutaciones de SWI/SNF con las de otros genes complican la visión de conjunto de las funciones y amplían las posibles relaciones con otras vías metabólicas, proporcionando una fuente para ulteriores estudios de los mecanismos que SWI/SNF desempeña en el cáncer
La accesibilidad al DNA también está regulada por las enzimas modificadoras de las histonas como las “polycomb represor complex” (PRC1, PRC2). Para entender como defectos de SWI/SNF podrían conducir al cáncer es importante considerar el antagonismo entre SWI/SNF y PRC. PRC2 aislado en mamíferos está compuesto por al menos cinco subunidades: EZH1 o EZH2, EED, SUZ12, RBBP4/7 Y AEBB2 [28].
Dependiendo del contexto, como en SWI/SNF las subunidades pueden asociarse en diferentes maneras. EZH1 y EZH2 catalizan la aposición de grupos metilos en los residuos de lisina. Brevemente, en este marco biomolecular, su función principal en la regulación de la expresión génica es de represor gen-específico. SWI/SNF y PRC se conservan ambos de forma evolutiva, aunque SWI/SNF presenta más modificaciones entre los eucariotas, probablemente para adaptarse a características evolutivas como la pluricelularidad, la organogénesis y la presencia de órganos complejos como el sistema nervioso [29].
El antagonismo entre SWI/SNF ha sido en principio observado en Drosophila, donde se han reportado funciones opuestas en la regulación de la expresión génica y en desarrollo [30]. Esta oposición se debe probablemente a una combinación de distintos factores como la variación en la composición de ambos complejos, modificaciones preexistentes de la cromatina y modulaciones alostéricas de sus respectivas actividades enzimáticas. Se puede imaginar que ligeros cambios en este fino balance pueden ser deletéreos para la homeóstasis celular y seguramente SWI/SNF y PRC están fuertemente asociados a enfermedades como el cáncer [31-33].
Se conoce que mutaciones de EZH2, la subunidad catalítica de PRC2, puede conducir a aberrantes metilaciones en los residuos de lisina en las histonas 3, un estado de represión de la expresión que ha sido observado en varios tipos de cáncer [33]. El mejor ejemplo estudiado de antagonismo SWISNF-PRC ha sido en tumores rabdoides [34,35].
El knockout de EZH2 puede prevenir la oncogénesis guiada por la pérdida de SNF5 en ratón [36] y la inhibición farmacológica EZH2 lleva a muerte celular en los tumores MRT SNF5-negativos y a una duradera regresión del tumor en ratón [37]. Resulta interesante, la presencia de BRG1 ATP-asa es necesaria para la génesis tumoral inducida por la pérdida de SNF5, mientras la subunidad alternativa BRM no es expresada en la mayoría de las líneas de células tumorales MRT [37]. Un ulterior aclaramiento sobre las implicaciones de estos dos complejos en los mecanismos de proliferación y diferenciación celular, Charles Roberts, Bradley Bernstein Peter Park y colegas han examinado la distribución y la localización en la cromatina en tumores SNF5-deficientes y en líneas celulares tumorales. Se ha encontrado que una parte sustancial de SWI/SNF, adicionalmente a los promotores, se relaciona con los llamados super enhancer (cluster de enhancer activos) en las células wild type. Es interesante observar que la pérdida de SNF5 impide el ensamblaje del complejo en los promotores y en los típicos enhancers, mientras la interacción con los super enhancer se ve mínimamente afectada por la pérdida de SNF5. Los autores proponen que, ya que los típicos enhancer regulan la expresión de genes implicados en la diferenciación celular y mantenimiento de la identidad celular y del tejido, mientras los super enhancer regulan la proliferación y la auto-renovación celular, la redistribución de SWI/SNF podría impedir la diferenciación de las células SWI/SNF-deficientes al mismo tiempo que estas conservan su capacidad proliferativa, de auto-renovación y supervivencia, promoviendo en fin la génesis tumoral [38].
Este último estudio desde los laboratorios Robert, se enfoca en el cáncer asociado a inactivación de ARID1A. Los autores han visto que KO específico de Arid1a en tejido del colon en ratón se relaciona con en el desarrollo de un adenocarcinoma invasivo, comparable al cáncer colo-rectal humano. Los autores han observado que la mayoría de los complejos SWI/SNF unidos a los enhancer están inactivos en ratones ARID1A – deficientes causando así desregulación en la expresión de genes implicados en el desarrollo y auto-renovación. Los complejos SWI/SNF no afectados por la pérdida de ARID1A se mantienen funcionales gracias a la isoforma ARIDB1 y su presencia parece ser fundamental para la supervivencia del tumor. Estos últimos estudios identifican un rol antes desapercibido para el complejo SWI/SNF en los genes enhancer y super enhancer, definiendo ulteriormente los mecanismos epigenéticos a través de los cuales defectos en el sistema SWI/SNF-PRC conducen al cáncer, abriendo además nuevas rutas terapéuticas.
1.5 Cáncer de testículo y esterilidad
Las disfunciones reproductivas y las maliñidades andrológicas, representan un problema de interés creciente. Previo al tratamiento, los pacientes con cáncer de testículo o de próstata a menudo muestran parámetros seminales parecidos a los pacientes estériles o subfebriles [39]. Este hecho es evidenciado en los casos en que la malignidad es diagnosticada en hombres que se estudian por esterilidad. Eva Tvrda et al. exponen datos epidemiológicos concluyendo que los fallos reproductivos podrían actuar de precursores de futuras malignidades andrológicas como cáncer de testículo y de próstata, proporcionando un estímulo para futuras y más específicas investigaciones en salud reproductiva masculina y enfatizan la importancia de estas relaciones para los médicos que se ocupan de pacientes masculinos con disfunciones reproductivas.
El cáncer de las células germinales de testículo (TGCT) constituye el 95% de los canceres de testículo. Se divide en dos subtipos, seminoma y no-seminoma y cada uno representa alrededor del 50% de los TGCT. El seminoma es el cáncer más común entre los hombres jóvenes en los países industrializados.
Durante las últimas décadas se ha notado un incremento de la incidencia de TGCC en los hombres. Entre los hombres estadounidenses la incidencia ha aumentado del 3.8 a 6.8 casos por 100.000 personas año desde 1975 a 2002 [40]. Más drásticos aumentos se han visto en los países escandinavos donde de 3.5 a 10 casos por 100.000 personas por año desde 1960 a 2000 [41]. La condición de esterilidad / subfertilidad es uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de TGCT en hombres adultos y puede preceder la tumorgénesis en algunos años [41,42]. Durante el mismo periodo hay una evidencia global en el declive de la calidad seminal y de la fertilidad en los países industrializados [43,44]. Sin embargo, no está claro si estos dos hechos son independientes o están relacionados entre ellos. Otros estudios epidemiológicos han investigado la asociación entre esterilidad masculina y cáncer de testículo con resultados muy heterogéneos [45-49]. Un amplio estudio de cohorte (datos provenientes de 51.461 parejas examinadas por esterilidad en California han sido cruzados con 22.562 hombres identificados en el registro californiano del cáncer) concluye que los hombres con esterilidad son 3 veces más propensos a desarollar el TC comparados con población masculina sin alteración reproductiva y sugieren la existencia de factores etiológicos comunes en ambos cuadros clínicos [50].
A pesar las investigaciones en este contexto, la etiología de los TGCT no está bien comprendida. Pérdida de heterocigosis, desequilibrio alélico y amplios estudios genómicos de asociación (GWAS) han identificado algunos loci y genes que confieren susceptibilidad a los TGCT, aunque la mayoría de estos, no han sido funcionalmente caracterizados [51-54].
Basándose en estos datos, se han propuesto varios modelos de desarrollo de los TGCT, pero el evento inicial detrás de este cáncer todavía resulta desconocido. Un desafío en el estudio de los tumores sólidos está en el estudio de los eventos iniciales, que están conectados con la identificación de las células de origen del tumor. En los TGCT se conoce que tales células precursoras son células germinales estaminales, gonocitos o espermatogonias [55], los seminomas se desarrollan a partir de células neoplásicas germinales intratubulares (IGCN) [56]. A diferencia de otros tejidos, donde las células hijas de diferencian tempranamente, las células progenitoras de los testículos proliferan extendidamente. La elevada naturaleza proliferativa, implica que los eventos culminantes en tumores somáticos sean distintos en los TGCT y ya que estos ocurren con una baja frecuencia con relación a la alta tasa de proliferación del epitelio seminífero. A la luz de estas evidencias, nace la necesidad de desarrollar nuevos trabajos de investigación para ampliar la comprensión de la esterilidad masculina idiopática. Un punto de inicio de esa investigación es la hipótesis que mutaciones exnovo y daños no reparados del DNA pueden estar presentes en las células germinales, además de defectos en el control y la proliferación celular es decir un mecanismo común entre cáncer del aparato reproductor masculino y la esterilidad.
La clasificación más común para los tumores de las células germinales es aquella propuesta por la OMS. El principio fundamental en esta clasificación es que todos los tipos morfológicos de tumor, excepto el seminoma espermatocítico y algunas formas especializadas de teratoma, derivan desde células germinales neoplásicas que se diferencian a lo largo de distintas vías. La estrecha relación entre estos diferentes tipos morfológicos de tumor con las denominadas “células germinales intratubulares de tipo non clasificado” IGCNU, proporciona un convincente soporte a este punto de vista [57]. Cuando se analizan pacientes con esterilidad, no siempre es fácil distinguir si esto es debido a criptorquidia o disgenesia gonádica. Sin embargo, una menor fertilidad se espera en ambos casos y el riesgo de estos pacientes a desarrollar IGCNU es aún objeto de discusión. En un estudio, emerge que el 22% de pacientes con IGCNU presentan también criptorquidia [58]. Otros sugieren que no hay claras evidencias que la esterilidad en ausencia de criptorquidia esté significativamente asociada con el aumento de riesgo de cáncer de testículo [59]. Algunos estudios reportan una frecuencia muy baja de IGCNU en hombres subfertiles [60-62] Sin embargo parece que pacientes estériles presenten un mayor riesgo de padecer tumores de células germinales, especialmente aquellos con historia de criptorquidia o atrofia testicular. Tales pacientes a menudo muestran oligozoospermia severa o azoospermia [49].
La mayoría de las células tumorales de testículo evolucionan desde una lesión común neoplásica precursora [63-65]. En pasado, dos diferentes vías han sido postuladas; una llevaría al seminoma y otra al carcinoma embrionario, mientras el seminoma era considerado el estadío final de la neoplasia, el carcinoma embrionario, se pensaba capaz de formar tumor del saco de Yolk, teratoma y coriocarcinoma. La existencia de formas específicas de neoplasias intratubulares, soportan la teoría que una neoplasia maligna intratubular origine diferentes tipos de células tumorales. La frecuencia de metástasis no seminales en autopsias de pacientes fallecidos posteriormente a una orquiectomía que mostraba solo seminoma, se relaciona con el concepto que los seminomas pueden evolucionar en otros tipos de tumor.
En la forma más común, las IGCNU consisten en una proliferación basal de células germinales indiferenciadas, atípicas y grandes células con citoplasma. Skakkebaek [66-67], por primero describió células germinales atípicas en los testículos de dos hombres estériles en 1972 y especuló que estas, podrían representar una fase preinvasiva de cáncer de testículo. Trabajos posteriores han verificado esta hipótesis al punto que tales células han sido nombradas, especialmente en Europa, carcinoma en situ (CIS) aunque el término recomendado sucesivamente en congreso de patólogos en la universidad de Minnesota en 1980 es intratubular germ cell neoplasia unknown (IGCNU). Este término ha sido preferido porque las células germinales malignas no poseen propiedades epiteliales y no siempre dan lugar a carcinomas [68,69].
La evidencia de que las IGCNU con una forma de neoplasia in situ deriva de varias fuentes. Cabe destacar, en un estudio, pacientes con IGCNU que han sido seguidos a lo largo de años desarrollan células germinales tumorales con una tasa del 50% dentro de 8 años y muy pocos no han desarrollado células tumorales después de 15 años [70]. Otros estudios también soportan la naturaleza neoplásica y precursora de las IGCNU. Estudios de ploidía muestran que las IGCNU son anueoploides [71]. Las IGCNU y las adyacentes células germinales expresan el característico factor de crecimiento alpha receptor gene [72]. IGCNU y seminomas presentan un perfil de expresión similar por las proteínas C-KIT (CD117), OCT3/4 NANOG Y PLAP [73,74].
Las IGCNU en ausencia de tumor invasivo son asintomáticas y se suelen encontrar en biopsias testiculares, propuestas por otras indicaciones y screening. Los testículos que presentan IGCNU sueles ser más pequeños y los individuos suelen presentar oligozoospermia [75]. En el screening por IGCNU hay una probabilidad mayor de encontrar una biopsia positiva en testículos atróficos [76,77].
Las biopsias testiculares son muy sensibles en la detección de IGCNU. Se ha estimado que las IGCNU pueden ocupar, en muchos casos, el 2% del volumen testicular y una única biopsia podría detectar IGCNU en un 50% de los casos y si las IGCNU ocupan más del 10%, podrían detectarse virtualmente en todos los casos [78]. Otro estudio calcula que una o dos biopsias de 3 mm de diámetro podrían detectar todos los casos. En confirma esta alta sensibilidad, sólo 1 entre más de 1500 pacientes con esterilidad y/o testículo mal descendido y biopsia testicular negativa ha desarrollado el cáncer después de 8 años [79].
Posibles candidatos para screening/biopsia incluyen aquellos con historia de cáncer de testículo, pacientes con ambigüedades somato-sexuales y del cromosoma Y, aquellos en que se presume un tumor extra gonadal en que las metástasis puedan derivar desde una regresión de tumor testicular y en los pacientes con criptorquidia [80,81] Si en los pacientes infértiles con oligozoospermia debería ser indicada una biopsia testicular por IGCNU no está claro. Algunos urólogos tienen cuidado en recomendar una biopsia testicular, ya que el procedimiento es bastante invasivo y el resultado, sea positivo o negativo no influye mucho en los siguientes pasos.
Las IGCNU presentan propiedades IHQ parecidas a las de las células gemínales fetales. Marcadores de células germinales inmaduras son útiles para la confirmación o la detección de la presencia de IGCNU. Positividad para PLAP se presenta en el 90% de los casos [82,84] y se presenta como reactividad de la membrana, y en medida menor del citoplasma, para la coloración. La positividad PLAP es útil también cuando el sólo examen microscópico no aclare del todo la presencia de IGCNU.
OCT3/4 es un factor de transcripción expresado en casi todos los casos de IGCNU y es negativo en el parénquima testicular no neoplásico [85-87]. Su positividad se distingue por una fuerte coloración del núcleo. NANOG es otro factor de transcripción con propiedades parecidas a las de OCT3/4, aunque la experiencia en su utilización como marcador de IGCNU es limitada [88]. C-KIT (CD117) es positivo en alrededor de los 90% de los casos [89,90]
Hoy en día, los pacientes con cáncer de testículo pueden contar con una larga expectativa de vida y pueden ser curados de la enfermedad. El mejor pronóstico se produce desde un mejor diagnóstico y tratamiento. Sin embargo, la mayoría de los pacientes que sufren cáncer de testículo son jóvenes y aún no han planeado su vida reproductiva y familiar, así que la influencia del tratamiento sobre la espermatogénesis, así como la preservación de la fertilidad (congelación de semen) es de fundamental importancia.
Importante es la calidad seminal que presentan cuando la malignidad se diagnostica o se sospecha, para permitir la eventual congelación de del semen.
La causa o el mecanismo de los efectos deletéreos que el tumor ejerce sobre la calidad seminal aún no están claros. Sin duda una disminución del epitelio seminífero sano tiene sus consecuencias. Dos estudios examinan los efectos de seminomas y no seminomas en la calidad seminal, encontrando una evidente alteración de los tres parámetros principales (concentración, motilidad y morfología) [91,92]. No han sido encontradas diferencias significativas en los parámetros principales entre los dos tipos de tumor después de descongelación del semen, aunque antes de congelar la motilidad y la concentración era mucho más altas en los seminomas respecto a los no seminomas. En el mismo estudio se menciona el seguimiento en la pareja respecto a tasa de fecundación, de embarazo y nacidos vivos después de técnicas de fecundación in vitro con semen descongelado de paciente oncológico con seminoma y no seminoma. Lamentablemente los datos son muy pocos y no se puede llegar a conclusiones estadísticamente significativas.
En una revisión histológica se comparan láminas procedentes de oquiectomía de 14 pacientes con seminoma con 12 pacientes con carcinoma embrionario [91].
Los dos tipos de tumores exhiben una igual disminución de la espermatogénesis en las regiones próximas a la lesión principal pero los individuos con carcinoma embrionario presentan un score más bajo en las regiones remotas a la masa tumoral. La presión que ejerce la masa tumoral no parece influir significativamente en la reducción de la espermatogénesis y/o en la calidad seminal, mientras parece depender más del grado de malignidad del tumor. Cuanto antes pero, no explica el mayor grado de desorden de la espermatogénesis en proximidad de la lesión. Los desórdenes de la espermatogénesis en hombres con cáncer de testículo podrían ser hereditarios y esos mismos conllevarían a una mayor predisposición al desarrollo de neoplasias testiculares. Otra explicación probable es que los efectos deletéreos del tumor sobre la espermatogénesis estén causados por sustancias producidas por las células el tumor mismo, actuando de forma autocrina o paracrina. Por ejemplo, el factor de necrosis tumoral e interleukina-1, afectan la producción de testosterona excretada por las células de Leydig en ratones adultos [94].
II APROXIMACIÓN EXPERIMENTAL: RELACIONES ENTRE SWI/SNF, CÁNCER DE TESTICULO Y DISFUNCIONES DE LA ESPÉRMATOGENESIS.
2.1 Diseño experimental
Objetivos: Planteada la hipótesis de una mutua relación entre oncogénesis de tumor testicular y algún caso de alteración de la fertilidad se propone definir el perfil de expresión de las subunidades de SWI/SNF en espermatogénesis y en tumores de las células germinales; comparar, utilizando técnicas IHQ, la presencia de marcadores para el cáncer de testículo con BRM y ARID2 en los distintos casos.
Muestras para el estudio: Muestras de tejido provenientes de orquiectomía y biopsias testiculares del Complejo Hospitalario Universitario de Canarias (HUC) elencadas en la tabla (1).
IHQ y anticuerpos: Preparación de las secciones histológicas: Fijación del tejido en formaldehido 4% durante 24 horas, deshidratación e infiltración en parafina con sistema automatizado TISSUE TEK VACUM INFILTRATION PROCESSOR. La IHQ se ha realizado con: BenchMark ULTRA automated IHC/IHS slide staining system con Sistema cromóforo DAB-Peroxidase Substrate Solution (Brown). Anticuerpos monoclonales BRM (SMARCA4), ARID2 (SMARC2), PLAP, CD117 comercializados.
Adquisición de las imágenes: Microscopio Leica con cámara RGB color.
Analisis de los datos
Las muestras de tejido se han estudiado en su totalidad, seleccionando al menos 3 distintos campos para el cálculo del qIHC score.
El cálculo del valor de nivel de IHQ (qIHC score), se ha llevado a cabo con una ampliación del sistema, utilizado por el plugin IHC PROFILER [93], compatible con el software de análisis de imagen imageJ (imagej.nih.gov). El método empleado, permite asignar un valor de 1 a 4 con variable continua,en relación al número de pixels del color de interés (color reacción DAB) respecto al total contenido en la imagen adquirida y la distribución de las intensidades de los mismos (n.d.a.: el método ha sido ideado en el marco de este trabajo y necesita verificación).
Para la representación del perfil de expresión proteico de ARID2, BRM, BRG1, BRD7, se han utilizado datos procedentes de estudios espermatogénesis en ratones integrados con el análisis informatico de las imágenes obtenidas y aquellas disponibles en la base de datos del the human protein atals.
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