Durch die Entstehung immer neuer Resistenzen und Bildung multiresistenter Stämme von Bakterien gegen herkömmliche Antibiotika, hat die Bedeutung der Erforschung und Evaluierung von Antibiotikawirkorten und –Mechanismen zur Entwicklung neuer Antibiotika zugenommen. Dazu können antibakteriell wirkende Stoffe auf ihre molekularen Funktionen hin untersucht werden, um z.B. Verbesserungen zu erreichen, aber auch potentielle Wirkorte für die Entwicklung neuer Antibiotika lokalisiert werden. Um diese molekularen Interaktionen untersuchen zu können, bedient man sich der modernen Proteomanlayse. Hierbei spielt die zweidimensionale, elektrophoretische Auftrennung von Proteinen (2D-Gelelektrophorese) eine große Rolle.
In diesem Praktikum wurden Carrier-Ionophoren verwendet: Ionomycin, ein Ionophor, der in Streptomyces conglobatus vorkommt und vor allem Ca2+ durch Membranen transportiert. Calcimycin, das mehrere zweiwertige Kationen (Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ >> Sr2+ > Ba2+) durch Zellmembranen transportieren kann und z.B. dafür sorgt, dass die Atmungskette entkoppelt wird. Und Nigericin, das H+, K+ und Pb2+ durch Zellmembranen befördern kann, aber meistens als H+-K+-Antiporter vorliegt. Ionophore werden, nicht nur als Antibiotikum, in vielen Bereichen der Forschung eingesetzt, sondern kommen auch in der industriellen Viehzucht zum Einsatz. Des Weiteren sollte während des Praktikums eine Konditional-Mutante für essentielle Zellteilungsgene von B. Subtilis erstellt werden, um mit anschließender Proteomanalyse mögliche Wirkorte für Antibiotika zu evaluieren.
Inhaltverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Medien und Antibiotika
2.1.2 Puffer und Lösungen
2.1.2.1 Puffer und Lösungen zur Herstellung kompetenter E. coli -Zellen
2.1.2.2 Puffer und Lösungen zur Probenaufbereitung
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellung kompetenter E. coli- Zellen
2.2.2 Transformation
2.2.3 Bakterienanzucht
2.2.4 Bestimmung des Bakterienwachstums
2.2.5 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
2.2.6 Durchführung von Wachstumstests
3. Ergebnisse
3.1 Bestimmung der MHK verschiedener Antibiotika
3.2 Wachstumstest
3.2.1 Wachstumstest mit Ionomycin:
3.2.2 Wachstumstest mit Calcimycin:
3.2.3 Wachstumstest mit Nigericin:
3.3 Erstellung einer B. subtilis -Konditionalmutante
3.3.1 Isolation chromosomaler DNA von B. subtilis und B. megaterium
3.3.2 Vermehrung und Isolation des Klonierungsvektors pDG1731
4. Diskussion
4.1 Bestimmung der MHK und Wachstumstests
4.2 Erstellung einer B. subtilis -Konditionalmutante
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