Visualization and tracking of single fluorescent molecules is a recent development in optical microscopy holding great promise for the study of cell biological processes. However, the detection and characterization of single molecules in three-dimensionally (3D) extended systems such as living cells has yet to be accomplished. By carefully choosing the hardware components of the microscope and a detailed theoretical description of the imaging process, the imaging conditions could be optimized for single molecule tracking experiments inside the cell nucleus. We developed a two-color widefield fluorescence microscope equipped with an Ar-laser and a He-Ne-laser and two CCD cameras. By programming the hardware of the CCDs we achieve a maximum frame repetition rate of 125Hz. In the first step single protein molecules of the green fluorescent protein (GFP) were detected at room-temperature in 3D-solutions with a time resolution of up to 13ms. The 2D localization precision was determined to be ~25nm. From the trajectories, the diffusion coefficients of single GFP molecules were derived and found to agree well with theoretical expectations. Using the recombinant E. coli ß-galactosidase protein P4K, single molecules could be tracked in the nuclei of 3T3-cells at a spatial accuracy of ~30nm and a time resolution of 18ms. These results suggest that proteins can move inside the nucleus over extended distances by diffusion. However, intranuclear protein diffusion is severely restricted, most likely by multiple association-dissociation events and/or impermeable obstacles. In a further step we examined the intranuclear dynamics of the splicing-factor U1-snRNP on a single molecule level. From these results we derived a model for the dynamics of U1-snRNPs. This model substantiates the view that nuclear speckles are not rigid structures but highly dynamic domains characterized by a rapid turnover of U1-snRNPs and other splicing factors.
Inhaltsverzeichnis
- 1 Einleitung
- 1.1 Hintergrund und Zielsetzung
- 1.2 Übersicht
- 1.2.1 Theoretischer Teil
- 1.2.2 Experimenteller Teil
- 1.2.3 Kooperationen
- 1.3 Biologische Grundlagen
- 1.3.1 Das "Green-Fluorescent-Protein" (GFP)
- 1.3.2 Das Fusionsprotein P4K
- 1.3.3 Der Spleißfaktor "U1 small nuclear ribonucleoprotein" (U1-snRNP)
- 1.3.4 Zum Kern-Zytoplasma-Transport
- 2 Theoretischer Teil
- 3 Experimenteller Teil
- 4 Ergebnisse
- 4.1 Charakterisierung der Proteinfluoreszenz
- 4.2 Autofluoreszenz intakter und permeabilisierter Zellen
- 4.3 Die zweidimensionale Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
- 4.3.1 Bestimmung des minimalen SRVs
- 4.3.2 Bestimmung des axialen Detektionsintervalls
- 4.3.3 Simulation zur Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
- 4.4 Zur Wahl der Aufnahmeparameter
- 4.4.1 Das Objektiv
- 4.4.2 Wieviele Photonen werden zur Detektion eines Moleküls benötigt?
- 4.4.3 Die Anregungsintensität
- 4.4.4 Die Belichtungszeiten
- 4.4.5 Welche Diffusionskonstante kann maximal gemessen werden?
- 4.5 Der Einzelmolekülnachweis
- 4.6 Abbildung einzelner GFP- und Antikörper-Moleküle in dreidimensionalen Proben
- 4.6.1 Nano-Lokalisierung einzelner immobiler GFP-Moleküle in PAA-Gel
- 4.6.2 Abbildung einzelner diffundierender GFP-und Antikörper-Moleküle
- 4.7 Mobilitätsmessungen an einzelnen P4K-Molekülen im Zellkern
- 4.7.1 Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
- 4.7.2 Tracking einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
- 4.7.3 Analyse der Trajektorien einzelner P4K-Moleküle
- 4.8 Analyse der Dynamik des Spleißingfaktors U1-snRNP
- 4.8.1 Die intranukleare Verteilung von U1-snRNP
- 4.8.2 Visualisierung einzelner U1-snRNP-Partikel im Zellkern
- 4.8.3 Bewegung der U1-snRNPs aus dem axialen Detektionsvolumen
- 4.8.4 Analyse der Trajektorien einzelner U1-snRNP-Partikel
- 4.8.5 Bestimmung der Dissoziationsrate der U1-snRNPs von den Bindungsstellen
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Arbeit zielt auf die Entwicklung und Anwendung fluoreszenzmikroskopischer Methoden zur Visualisierung und Analyse der Dynamik einzelner Proteinmoleküle im Zellkern ab. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen zum Verständnis der intranuklearen Organisation und der Prozesse beitragen, die diese Organisation herbeiführen und aufrechterhalten.
- Entwicklung von Methoden zur Einzelmoleküldetektion im Zellkern
- Analyse der intranuklearen Dynamik des Fusionsproteins P4K
- Untersuchung der Dynamik des Spleißfaktors U1-snRNP
- Optimierung der fluoreszenzmikroskopischen Bildaufnahmeparameter
- Entwicklung eines Modells zur Beschreibung der Dynamik von Spleißfaktor-Kompartimenten
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Die Einleitung beschreibt den Hintergrund der Forschung zur submikroskopischen Organisation des Zellkerns und die Limitationen bestehender Methoden wie FRAP und FLIP. Sie hebt die Notwendigkeit der Einzelmoleküldetektion hervor, um ein detaillierteres Verständnis der intranuklearen Dynamik zu erlangen und benennt die Zielsetzung der Arbeit: die Entwicklung und Anwendung von Methoden zur direkten Visualisierung und Analyse einzelner Proteinmoleküle im Zellkern, speziell des Fusionsproteins P4K und des Spleißfaktors U1-snRNP.
2 Theoretischer Teil: Dieser Teil legt die theoretischen Grundlagen für die experimentelle Arbeit dar. Er beschreibt den Aufbau und die Funktionsweise der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, die Punktübertragungsfunktion (PSF), die Auflösungs- und Lokalisierungsgenauigkeit, die Fluoreszenz- und Photobleichkinetik sowie die Methoden zur Analyse von Molekültrajektorien. Besonderes Augenmerk liegt auf der Behandlung der zweidimensionalen Projektion dreidimensionaler Molekülbewegungen und der Optimierung von Aufnahmeparametern wie Belichtungszeit, Anregungsintensität und Pixelgröße.
3 Experimenteller Teil: Der experimentelle Teil beschreibt detailliert den Aufbau des verwendeten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops, inklusive der verwendeten Komponenten und der Optimierung der Detektionseffizienz. Die Probenpräparation für die verschiedenen Experimente (immobile und mobile Proteine in verschiedenen Medien, Zellen) wird ausführlich erläutert, ebenso wie die Methoden der Bildauswertung und die Durchführung von Einzel- und Zweifarbenexperimenten. Die Anwendung der High-Speed-Framing-Technik zur Erhöhung der Zeitauflösung wird beschrieben.
4 Ergebnisse: Dieser Abschnitt präsentiert die experimentellen Ergebnisse. Zunächst wird die Charakterisierung der Fluoreszenz der verwendeten Proteine und die Autofluoreszenz der Zellen beschrieben. Anschließend werden die Ergebnisse der Einzelmoleküldetektion an Modell-Systemen (GFP in Glycerin) präsentiert, um die Leistungsfähigkeit des entwickelten Verfahrens zu demonstrieren. Der Hauptteil dieses Kapitels widmet sich der Darstellung und Analyse der Ergebnisse der Einzelmoleküldetektion von P4K und U1-snRNP im Zellkern. Hierbei werden die unterschiedlichen Mobilitätsmodi der Proteine quantitativ beschrieben und interpretiert.
Schlüsselwörter
Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Einzelmoleküldetektion, Proteinmobilität, Zellkern, Intranukleare Dynamik, P4K, U1-snRNP, Spleißfaktor, Trajektorienanalyse, Diffusionskonstante, eingeschränkte Diffusion, Signal-Rausch-Verhältnis, Lokalisierungsgenauigkeit, Speckles.
Häufig gestellte Fragen (FAQ) zur Arbeit: Visualisierung und Analyse der Dynamik einzelner Proteinmoleküle im Zellkern
Was ist das Thema dieser wissenschaftlichen Arbeit?
Die Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung fluoreszenzmikroskopischer Methoden zur Visualisierung und Analyse der Dynamik einzelner Proteinmoleküle im Zellkern. Der Fokus liegt auf dem Verständnis der intranuklearen Organisation und der Prozesse, die diese Organisation herbeiführen und aufrechterhalten.
Welche Proteine werden untersucht?
Die Arbeit untersucht die intranukleare Dynamik des Fusionsproteins P4K und des Spleißfaktors U1-snRNP. Das Green Fluorescent Protein (GFP) wird als fluoreszentes Markerprotein verwendet.
Welche Methoden wurden angewendet?
Die Hauptmethode ist die Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, speziell die Einzelmoleküldetektion. Es wurden Methoden zur Optimierung der Bildaufnahmeparameter (Belichtungszeit, Anregungsintensität, etc.) entwickelt und angewendet. Die Analyse der Molekültrajektorien spielt eine zentrale Rolle bei der Dateninterpretation. Die Arbeit behandelt auch die zweidimensionale Abbildung dreidimensionaler Trajektorien.
Welche Ziele wurden verfolgt?
Die Hauptziele waren die Entwicklung von Methoden zur Einzelmoleküldetektion im Zellkern, die Analyse der intranuklearen Dynamik von P4K und U1-snRNP, die Optimierung der fluoreszenzmikroskopischen Bildaufnahmeparameter und die Entwicklung eines Modells zur Beschreibung der Dynamik von Spleißfaktor-Kompartimenten.
Wie ist die Arbeit strukturiert?
Die Arbeit gliedert sich in eine Einleitung, einen theoretischen Teil, einen experimentellen Teil und einen Ergebnis-Teil. Die Einleitung beschreibt den Hintergrund und die Zielsetzung. Der theoretische Teil legt die physikalischen und biologischen Grundlagen dar. Der experimentelle Teil detailliert die Methoden und die Durchführung der Experimente. Der Ergebnis-Teil präsentiert und interpretiert die gewonnenen Daten.
Welche Ergebnisse wurden erzielt?
Die Arbeit präsentiert Ergebnisse zur Charakterisierung der Proteinfluoreszenz und Autofluoreszenz. Es werden Daten zur Einzelmoleküldetektion von GFP in Modellsystemen und von P4K und U1-snRNP im Zellkern gezeigt. Die Ergebnisse beinhalten die quantitative Beschreibung und Interpretation der unterschiedlichen Mobilitätsmodi der untersuchten Proteine.
Welche Schlüsselwörter beschreiben die Arbeit am besten?
Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Einzelmoleküldetektion, Proteinmobilität, Zellkern, Intranukleare Dynamik, P4K, U1-snRNP, Spleißfaktor, Trajektorienanalyse, Diffusionskonstante, eingeschränkte Diffusion, Signal-Rausch-Verhältnis, Lokalisierungsgenauigkeit, Speckles.
Welche Limitationen bestehender Methoden werden angesprochen?
Die Einleitung erwähnt die Limitationen bestehender Methoden wie FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) und FLIP (Fluorescence Loss in Photobleaching) bezüglich der detaillierten Analyse der intranuklearen Dynamik einzelner Moleküle.
Welche Bedeutung haben die Ergebnisse?
Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der intranuklearen Organisation und der Prozesse bei, die diese Organisation herbeiführen und aufrechterhalten. Die entwickelten Methoden ermöglichen detaillierte Einblicke in die Dynamik einzelner Proteine im Zellkern.
Wo finde ich weitere Informationen?
(Hier könnte ein Link zur vollständigen Arbeit eingefügt werden.)
- Citation du texte
- Thorsten Kues (Auteur), 2001, Visualisierung einzelner Proteinmoleküle und Analyse ihrer Trajektorien in intakten Zellkernen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/178967
