Reverse-Engineering circadianer Oszillationssysteme als Frequenzregelkreise mit Nachlaufsynchronisation

Diplomarbeit , 2011 , 89 Seiten

Informatik - Bioinformatik

Die Komplexität der biochemischen Reaktionsnetzwerke, auf denen alles Leben basiert, verständlich zu machen, ist Kernanliegen der Systembiologie. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein Ansatz aus den Ingenieurwissenschaften, nämlich die Nachlaufsynchronisation, genutzt, um das Verhalten circadianer Oszillationssysteme zu simulieren und zu analysieren. Die Nachlaufsynchronisation (Phase-locked loop, PLL) ist ein Spezialfall einer Frequenzegelung,
wie sie in den Ingenieurwissenschaften definiert ist: ein dynamisches System wird innerhalb eines geschlossenen Wirkungskreises zielgerichtet beeinflusst (1). Die Regelungstechnik fand bereits früh Eingang in die theoretische Biologie. Regelkreise sind gut zur Beschreibung von biologischen Systemen geeignet; sie profitieren von einer strengen Modularisierung, die eine klare Aufteilung eines komplexen Systems in funktionale Untereinheiten, die durch Signalpfade verbunden sind, ermöglicht. In dieser Diplomarbeit wird ein regelkreis-basierter Modellierungsansatz vorteilhaft zur Beschreibung und Analyse eines circadianen Oszillators einschließlich seiner Fähigkeit zum Entrainment angewendet. Oszillationen eignen sich besonders für die Modellierung mithilfe von Regelkreisen, da zahlreiche Methoden zur Analyse des Verhaltens von Frequenzregelkreisen existieren.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Circadiane Rhythmen
2.1 Rhythmen in der Natur
2.2 Molekularer Mechanismus circadianer Rhythmen
2.3 Entrainment

3 Analyse des dynamischen Verhaltens biochemischer Reakti­onsnetzwerke
3.1 Modellierung mittels Differentialgleichungen
3.2 Analyse von Differentialgleichungssystemen
3.3 Oszillierende Systeme
3.4 Periode und Frequenz einer Oszillation und deren Bestimmung
3.5 Der Goodwin-Oszillator

4 Frequenzregelkreise nach dem Prinzip der Nachlaufsynchro­nisation
4.1 Grundbegriffe der Regelungstechnik
4.2 Wirkungsprinzip der Regelung
4.3 Frequenzregelung
4.4 Nachlaufsynchronisation

5 Circadiane Uhren als Frequenzregelkreise mit Nachlaufsyn­chronisation - eine Fallstudie
5.1 Aufbau der Simulation
5.2 Beschreibung der Simulationen

6 Diskussion und Ausblick

Literaturverzeichnis

Kapitel 1 Einleitung

Ziel der Systembiologie ist es, ein ganzheitliches Verständnis der betrach­teten, in ihrem Rahmen untersuchten komplexen biologischen Systeme zu gewinnen (2). Dabei betrachtet man das komplexe Gesamtsystem als die Summe seiner einfacheren Teile. Die Analyse von Reaktionsnetzwerken mit­hilfe informatischer und mathematischer Methoden und Modelle bietet einen Anfangspunkt, der im Rahmen der Systembiologie oft genutzt wird, um Aspekte des komplexen Gesamtsystems ,,Zelle"zu verstehen. Dabei eröffnet sich jedoch ein weites Spektrum von sehr unterschiedlichen Möglichkeiten; die Grenzen dieses Spektrums stellen die Modellierung mittels Differential­gleichungssystemen auf der einen Seite und booleschen Netzwerken auf der anderen Seite dar. Differentialgleichungssysteme enthalten viele, detaillierte Informationen äber das System, zum Teil sind sehr genaue Angaben äber den Zustand des Systems zu einem bestimmten Zeitpunkt mäoglich. Diese Ge­nauigkeit hat allerdings den Nachteil, dass Modellierung und Verifikation mit hohem Rechenaufwand verbunden sind. Wäahrend Differentialgleichungssys­teme also sehr gut geeignet sind, das dynamische Verhalten kleinerer Syste­me zu berechnen und vorherzusagen, stellen groäßere Netzwerke aufgrund des hohen Rechenaufwands und der oft unvollstäandigen Beschreibungsdaten eine schwierige Herausforderung dar. Boolesche Netzwerke basieren hingegen auf der Annahme, dass ein Gen entweder eingeschaltet ist und das Genprodukt hergestellt wird, oder dass dies nicht der Fall ist. So lassen sich auch groäße- re Netzwerke mit verhaältnismaäßig geringem Rechenaufwand simulieren. Die Vereinfachung, mit der man sich diesen Vorteil erkauft, entspricht jedoch nicht der biologischen Realitat: Gene kännen verschieden stark aktiviert werden, sie sind nicht einfach entweder ein- oder ausgeschaltet. Andere Mo­dellierungsmethoden liegen mit ihrer Detailtreue und Komplexitaät zwischen diesen beiden Polen, und natuärlich gibt es auch Ansäatze, die auf mehreren dieser Grundmethoden aufbauen. So lasst sich etwa die Granularitat von booleschen Netzen durch Hinzufuägen eines weiteren Aktivierungszustandes, der z.B. einer mittelgroßen Aktivierung entspricht, erhohen (3).

Hier wird der Grundgedanke der Systembiologie, die Komponenten komple­xer Gesamtsysteme zu betrachten mit der Absicht aufgegriffen, die Oszil­lation und Eigenschaften circadianer Systeme durch Modularisierung an einem Beispielmodell zu erkläaren. Es gibt eher wenige direkte empirische Hinweise auf den Nutzen circadianer Rhythmen. Aufgrund ihrer weiten Ver­breitung wird jedoch angenommen, dass Organismen große Vorteile durch eine Anpassung an tägliche Rhythmen haben (4). Beispiele fur tatsächli­che Vorteile gibt es unter anderem bei den Cyanobakterien: mit Hilfe ihrer circadianen Uhr trennen sie chemische Reaktionen, die sensitiv auf ultra­violettes Licht reagieren, zeitlich von anderen Reaktionen und lassen sie bei Dunkelheit stattfinden. Hieraus ergibt sich ein Ablauf, bei dem die Tran­skription eines großen Anteils des gesamten Genoms nur wäahrend der Nacht stattfindet. Andere Beispiele sind das Verhalten von Trottellummen beim Fliegenlernen: Hierbei werden sie von Mowen gejagt. Bei der hächsten Akti­vität ist die Jagdrate am geringsten, sodass ein Abweichen von diesem zeit­lichen Rhythmus eine geringere Überlebenschance mit sich bringen wärde (5). Auch bei Experimenten mit Weißschwanz-Antilopenzieseln, Ammosper- mophilus leucurus (6) sowie Streifen-Backenhärnchen, Tamias striatus (7) hat sich gezeigt, dass das Vorhandensein eines circadianen Rhythmus von Vorteil ist: Individuen, bei denen der Teil des Gehirns, der fär den circa­dianen Rhythmus verantwortlich ist, entfernt wurde, litten unter groäßerer Mortalität, zum Teil verursacht durch erhohte Jagdverluste. Die Regelungstechnik bietet die Mäglichkeit, einzelne Elemente eines biolo­gischen Systems modular darzustellen, sodass deren Verhalten je nach Be­darf als Black Box mit geringem Rechenaufwand oder im Detail mit allen beteiligten Molekälen modelliert werden kann. Aufgrund dieser Eigenschaft bietet eine Modellierung als Regelkreis einen allgemeinen Ansatz, die vielen spezifischen, in der Natur vorkommenden circadianen Uhren zu verstehen. Hierbei wird der Versuch unternommen, einem mittels Differentialgleichun­gen modellierten Reaktionssystem und seinen bereits mit Werten belegten Parametern ein Modellsystem zuzuordnen, das auf Konzepten der Rege­lungstechnik beruht.

Diese Arbeit stellt nicht die erste Anstrengung dar, Ansäatze aus der Re­gelungstechnik zur Modellierung von biologischen Problemen zu verwen­den: Bereits 1953 stellt Drischel erste "Überlegungen in diese Richtung an (8). Ein allgemeines Feedback-Modell fär biologische Rhythmen stellte 1972 Johnson auf (9), und Lewis (10; 11; 12) nutzt ein auf Regelkreisen basie­rendes Modell, um den circadianen Rhythmus von Hemideina thoracica zu beschreiben. Dabei betont Lewis vor allem, dass der regelkreisbasierte An­satz die Läcke zwischen biologischen und mathematischen Modellierungs- ansaätzen schließt; dass dieser Ansatz auch innerhalb der mathematischen Modelle eine Sonderstellung einnimmt, bleibt unerwaähnt. Wolkenhauer (13) weist auf die hervorragende Verwendbarkeit von Blockschaltbildern zur Vi­sualisierung der Dynamik innerhalb biologischer Systeme hin, im Gegensatz zu statischen Netzwerkkarten, wie sie in der Biologie äblich sind. In (13) verwendet er Konzepte aus der Regelungstechnik zur Modellierung der Si- gnaläbertragung am Beispiel des JAK-STAT-Netzwerkpfades. In (14) wird eine regelungsbasierte Modellstruktur mit Black-Box-Techniken kombiniert, um die nichtlineare Dynamik von Reaktionssystemen zu berechnen. Diese Anwendung von Regelkreisen innerhalb biologischer Systeme äahnelt unter den genannten Ansätzen der Vorgehensweise dieser Arbeit, ist jedoch an- wendungsorientierter, statt die Mäglichkeiten fär die Grundlagenforschung aufzuzeigen.

Hier wird zunaächst auf circadiane Rhythmen eingegangen. Anschließend werden Grundlagen zu Regelkreisen und Nachlaufsynchronisation sowie zur Analyse des Verhaltens chemischer Reaktionssysteme erärtert. Auf diesen Grundlagen aufbauend wird im Kapitel 5 fär ein Beispielsystem ein Fre­quenzregelkreis mit Nachlaufsynchronisation hergeleitet und es werden Si­mulationsstudien zur Analyse dieses Regelkreises beschrieben. Im abschlie­ßenden Kapitel 6 werden diese Ergebnisse mit in der Natur und Technik vorkommenden Regelkreisen verglichen und weitere Richtungen, in denen der regelkreisbasierte Ansatz erfolgversprechend sein kännte, aufgezeigt.

Kapitel 2 Circadiane Rhythmen

2.1 Rhythmen in der Natur

Es gibt in der Natur zahlreiche periodisch stattfindende Ereignisse. Die Pe­riodendauer unterscheidet sich zwischen verschiedenen Ereignissen stark. So schlaägt zum Beispiel das Herz einer Ratte mehr als 300 mal pro Minute (15, S. 110), die Käorpertemperatur des Menschen veraändert sich im Laufe von 24 Stunden (15, S. 171) und der (Ostrogenzyklus bei weiblichen Hams­tern dauert durchschnittlich 4 Tage (16). Aufgrund dieser großen Bandbreite moäglicher Periodenläangen teilt man die betrachteten Rhythmen in ultradia­ne, circadiane und infradiane Rhythmen ein, also Rhythmen, die kärzer als einen Tag, ungefaähr einen Tag oder laänger als einen Tag dauern. Biologische Rhythmen sind bei fast allen Lebewesen vorhanden: bei Einzel­lern wie Chlamydomonas ebenso wie bei Pflanzen und Tieren. Um endogene circadiane Rhythmen von zufälligen oder scheinbaren Rhythmen abzugren­zen, mässen drei Kriterien erfullt sein:

- Der Rhythmus entsteht endogen, existiert also nicht ausschließlich durch aäußere Einwirkung
- Die Periodendauer liegt nahe bei 24 Stunden (ungefahr zwischen 19 und 28 Stunden)
- Er kann durch tagesperiodische aäußere Einfluässe, zum Beispiel Hell­Dunkel-Rhythmen, angepasst werden (17).

Wahrscheinlich haben sich circadiane Rhythmen im Laufe der Evolution mehrmals unabhängig voneinander entwickelt (18). Die molekularen Me­chanismen, die circadiane Rhythmen innerhalb der Zellen generieren, zeigen betraächtliche Unterschiede zwischen verschiedenen Arten von Organismen auf: Cyanobakterien, Pilze, hoähere Pflanzen und vielzellige Tiere unterschei­den sich hier deutlich (18; 19).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.1: Der externe Lichtzyklus hilft Pflanzen, ihre circadiane Uhr zu stellen. Diese reguliert zum Beispiel, zu welchem Tageszeitpunkt die Pflan­ze ihre Blüten öffnet. Carl von Linne, ein Botaniker, dessen grundlegendes Taxonomiesystem noch heute genutzt wird, wandte diese Erkenntnis an, um die Blumenuhr zu entwickeln. Bei dieser Uhr kann man anhand der Pflan­zenart, deren Blüten gerade geöffnet sind, die Zeit ablesen. Die Abbildung zeigt eine solche Blumenuhr in Mainau am Bodensee (20).

2.2 Molekularer Mechanismus circadianer Rhyth­men

In den meisten Organismen, die über einen circadianen Rhythmus verfügen, wird dieser durch eine oder mehrere negative und positive molekulare Rück­kopplungsschleifen gesteuert, an der sogenannte „Uhr-Gene" und deren Produkte beteiligt sind. Konkret lüuft dieser Prozess meist so ab, dass ein Genprodukt als Aktivator eines anderen Gens wirkt, welches seinerseits dann die Transkription des ersten Gens hemmt. Da Transkription und Translation sehr viel kürzer dauern als 24 Stunden, werden weitere Proteine benütigt, die diese grundlegende Ruückkopplungsschleife verlangsamen.

Die molekulare Uhr von Drosophila melanogaster

Als erstes Beispiel seien im folgenden die an der molekularen Uhr von Dro­sophila melanogaster beteiligten Gene und Proteine sowie ihre Interaktio­nen ausfuührlicher geschildert: Man kann die beteiligten Gene anhand ih­rer Genprodukte ordnen: drei beteiligte Proteine haben transkriptionsakti­vierende Funktion, clock (CLK), cycle (CYC) und Par-Domanen-Protein 1 e (PDPle). CLK und CYC sind Transkriptionsfaktoren mit Helix-Loop- Helix/PAS-Domünen und sie bilden Heterodimere. PDPle ist ein Leucin- Zipper-Transkriptionsaktivator (21; 22).

Drei weitere beteiligte Gene haben Produkte mit transkriptionsreprimieren- der Funktion, period (PER), timeless (TIM) und vrille (VRI). PER ist ein PAS-Domaünen-Protein und bildet mit TIM ein Heterodimer, das die CLK- CYC-Funktion inhibiert. VRI ist ein Leucin-Zipper-Transkriptionsrepressor. Schließlich andern einige der beteiligten Proteine die Stabilitüt anderer Fak­toren oder beeinflussen, wo in der Zelle sich diese Faktoren befinden. Zu den destabilisierenden Proteinen gehören doubletime (DBT), Casein Kinase 2 (CK2) und shaggy (SGG). DBT destabilisiert PER, CK2 destabilisiert ebenfalls PER und beeinflusst zudem dessen Lokalisation, und SGG phos- phoryliert TIM, um für eine Verlagerung der PER-TIM-Heterodimere in den Zellkern zu sorgen. PP2A ist eine Phosphatase, die PER durch Dephospho- rylierung stabilisiert. Slimb (SLMB) ist ein F-Box/WD40-Protein, das die Zerstürung phosphorylierter PER-Proteine durch Proteasome beschleunigt.

Kern des circadianen Oszillators sind zwei intrazellulüre Rückkopplungs­schleifen, deren wesentliche Elemente oben genannte Proteine sind: eine PER/TIM-Schleife und eine CLK-Schleife. Innerhalb dieser Schleifen wird die Transkription durch Rückkopplung beeinflusst. Posttranslationale Me­chanismen kontrollieren die Konzentrationen und die Lokalisation innerhalb der Zelle, sodass die Ruückkopplung zum richtigen Tageszeitpunkt statt­findet. Die beiden Schleifen nutzen unterschiedliche Mechanismen, um die Transkription waührend unterschiedlicher Phasen des Zyklus zu regulieren.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.2: Per-Tim-Interaktionen (21)

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Abbildung 2.3: Expressionsprofile der Uhrproteine PER (PERIOD) und TIM (TIMELESS). Auf der X-Achse ist die Zeitgeber-Zeit (ZT) in Stun­den aufgetragen. Die Tiere waren auf einen Rhythmus mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit synchronisiert. Auf der Y-Achse ist die relative Expression der Uhrproteine aufgetragen. (23)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.4: Positive CLK-R¨uckkopplungsschleife (21)

Dennoch sind sie beide CLK-CYC-abhaüngig, und dadurch miteinander verbunden. Die PER/TIM-Ruückkopplungschleife wird ebenfalls von beiden Schleifen benoütigt. Um sie zu initiieren, binden CLK-CYC-Heterodimere von der Mitte des Tages bis zur frühen Nacht an E-Box-Elemente (DNA­Sequenzen in der Promotorregion vor einem Gen) und aktivieren dadurch die Transkription von per und tim. Die Konzentration der Transkripte dieser Gene erreicht ihren Hohepunkt am frühen Abend, die der Proteine erst am spateren Abend. Die Verzügerung wird durch eine von DBT und moüglicherweise CK2 ausgelüoste, phosphorylierungsabhaüngige Destabilisie­rung von PER verursacht. Anschließend bindet phosphoryliertes PER an TIM und wird hierdurch, sowie durch PP2A, stabilisiert. Man vermutet, dass PP2A die durch DBT und CK2 phosphorylierten Aminosüauren wieder dephosphoryliert (21). DBT bleibt an PER gebunden, sodass ein PER-TIM-DBT-Komplex entsteht. SGG phosphoryliert TIM, CK2 und PER. Daraufhin wird der PER-TIM-DBT-Komplex in den Nukleus verlagert. Dort setzt DBT die Phosphorylierung von PER fort, wodurch PER ein stüarkerer Inhibitor wird. PER bindet an CLK und inhibiert die DNA-Bindung von CLK-CYC-Dimeren. Die Konzentration von hypophos- phoryliertem CLK steigt zusammen mit den Konzentrationen von per, tim und anderen E-Box/CLK-CYC-abhaüngigen Transkripten. Hieraus folgt, dass stabiles, hypophosphoryliertes CLK die E-Box-abhaüngige Transkrip­tion aktiviert. Zusaützlich zu den bereits genannten Funktionen aktiviert CLK-CYC vrille und pdp1 e.

Die zweite Rückkopplungsschleife hat clk als Basis: CLK-CYC bindet an die E-Boxen von vrille und pdp1 e, sodass diese beiden Gene am späten Tag und in der frühen Nacht verstärkt exprimiert werden. Die VRI-Konzentration steigt zusammen mit der Konzentration seiner RNA.

VRI bindet an den VRI/PDP1e-Boxen, regulatorischen Elementen von clk, und hat dort eine inhibierende Wirkung. Dementsprechend unterscheidet sich die Phase der clk-mRNA von der Phase jener Transkripte, die durch CLK-CYC/E-Box-Interaktionen reguliert werden. Am mittleren bis spüten Abend steigt die PDP1e-Konzentration, wodurch die clk-Transkription aktiviert wird. Die per/tim- und die clk-Rückkopplungsschleifen weisen beide eine rhythmische, CLK-CYC-abhüangige Transkription auf. Da die­se PER-TIM-abhüngig ist, liegt es nahe, dass die per /tim-Schleife für die clk-Schleife benüotigt wird. Der Rhythmus in den PER- und TIM­Konzentrationen bleibt bestehen, wenn eine der beiden mRNAs konstitutiv exprimiert wird, erst das Abschalten beider Rhythmen hat Einfluss auf den gesamten circadianen Rhythmus. Die Storung des clk-Rhythmus durch Erhoühung der clk-mRNA-Konzentration waührend ihres Tiefpunktes hat nur geringe Auswirkungen auf die CLK-Phosphorylierung und circadiane Verhaltensweise, clk-mRNA-Oszillation scheint also für die Funktion des circadianen Oszillators nicht notwendig zu sein.

Die molekulare Uhr von Synechococcus spongiarum

Regulatorische Mechanismen bei anderen Organismen arbeiten üahnlich. So findet man bei dem Cyanobakterium Synechococcus spongiarum die drei Uhr-Gene kaiA, kaiB, und kaiC. Das kaiA-Gen wird von seinem eigenen Promoter kontrolliert und kodiert einen Aktivator, der seine eigene Tran­skription durch Interaktion mit einem anderen Promoter hoch reguliert. Die Transkription der drei Gene findet fast synchron statt, wobei KaiB und KaiC nach ungefaühr zwoülf Stunden einen ausgeprüagteren Hoühepunkt haben als KaiA. KaiC scheint für die Erstellung der negativen Rückkopplungs­schleife verantwortlich zu sein, es inhibiert seine eigene Transkription. Die Stabilitüat des Oszillationsverhaltens von KaiA, KaiB und KaiC haüngt zu­dem von Phosphorylierung und Dephosphorylierung von KaiC sowie von Komplexbildung mehrerer KaiC und Austausch von phosphorylierten und dephosphorylierten Monomeren ab.

In (24) ist ein Modell für die circadiane Oszillation der Phosphorylierungs- zustünde von KaiC beschrieben: KaiC bildet in Anwesenheit von ATP Hexa- mere. Dieser Prozess lüuft jedoch im Vergleich mit der Frequenz der Oszilla­tion sehr schnell ab und hat wahrscheinlich keinen Einfluss auf die Oszillati­onsdynamik. Es findet jedoch ein Monomeraustausch statt, der Einfluss auf die Phosphorylierung hat, da z.B. ein hypophosphoryliertes Monomer durch ein hyperphosphoryliertes ersetzt werden kann. Die Rate dieses Austausches ist ein freier Parameter des Modells. Die Bindung und Lüosung von KaiA an KaiC geschieht sehr schnell. Wenn KaiA gebunden ist, findet die Phosphory- lierung von KaiC-Monomeren schneller statt. KaiB bindet an KaiC, sobald ein gewisser Grenzwert der Phosphorylierung überschritten ist, der zu ei­ ner Konformationsänderung von KaiC fährt. Die Bindung von KaiB ändert die Konformation der KaiC-Hexamere irreversibel. Die Bindungsraten von KaiB an KaiC sind ebenfalls hoch. Die Bindung von KaiB an KaiC indu­ziert eine Konformationsanderung von KaiC zu KaiC*. KaiA kann weiterhin an KaiC* binden, aber KaiA-KaiC*-Komplexe sind im Gegensatz zu KaiA- KaiC-Komplexen nicht phosphorylierbar. Zwischen den verschiedenenen Ar­ten von KaiC-Hexameren finden Monomer-Austausche statt. Abbildung 2.5 stellt diese Reaktionen vereinfacht dar, es gibt sehr viele unterschiedliche mägliche KaiC-Hexamere, da jedes Monomer einen eigenen Phosphorylie- rungszustand aufweist. Mori et al. haben die Reaktionen als stochastisches Modell implementiert (25). Bei diesem Modell wird zwischen hexamerischen Reaktionen, die die Bindung und Losläsung von KaiA und KaiB an KaiC bzw. KaiC* beschreiben, und monomerischen Reaktionen, die Phosphory­lierung, Dephosphorylierung und Monomer-Austausche beschreiben, unter­schieden. Das resultierende Verhalten entspricht der äblichen stochastischen Formulierung; stochastische Verfahren finden jedoch in dieser Arbeit keine Anwendung.

2.3 Entrainment

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Abbildung 2.5: Zyklus der Phosphorylierungszustände von KaiC (24)

Entrainment bedeutet, dass eine interne biologische Uhr mit einer freilaufen­den Periode (free-running period, FRP), die nicht genau 24 Stunden dauert, von außen so beeinflusst wird, dass sich die Periode an den 24-Stunden- Rhythmus ihrer Umgebung anpasst. Entrainment ist nicht gleichbedeutend mit Synchronisation, bei der sich nicht nur die Periode, sondern auch die Wellenform (waveform) der biologischen Uhr an den treibenden Rhythmus

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.6: Im oberen Teil der Grafik verdeutlicht das Er­gebnis einer Gel-Elektrophorese die In-Vitro-Oszillation der KaiC- Phosphorylierungszustaände: Das untere Band ist hypophosphoryliertes KaiC (NP-KaiC) und das obere Band enthält verschiedene Arten von hyperphos- phoryliertem KaiC (P-KaiC). Der untere Teil der Grafik ist eine Quantifizie­rung des Verhältnisses von P-KaiC zum gesamten KaiC (P-KaiC+NP-KaiC) als eine Funktion der Zeit (24).

anpasst (26; 27).

Dies ist nicht notwendigerweise der Fall, nur die Periode gleicht sich der Periode des Stimulus an, der fur das Entrainment verantwortlich ist. Ein Stimulus, der eine solche Angleichung bewirken kann, wird Zeitgeber ge­nannt. Um sicherzustellen, dass tatsächlich ein Entrainment stattgefunden hat, muss man zeigen, dass die Periode des Rhythmus gleich der Periode des Zeitgeberzyklus ist, mit einer stabilen, eindeutigen Phasenverschiebung (Phase Angle), und dass nachdem man den Organismus vom Zeitgeber iso­liert, die FRP wieder einsetzt, mit einer vom Zeitgeberzyklus bestimmten Phase (26).

Es existiert das Phanomen des „Maskierens"(Masking), bei dem es so scheint, Entrainment habe stattgefunden, die FRP aber nach Isolation vom Zeitgeberzyklus mit einer nicht durch die Phase des Zeitgebers vorhersag­baren Phase neu beginnt (26; 27).

Das Entrainment hat mehrere Funktionen im Organismus:

- Es liefert eine interne Schatzung der externen lokalen Zeit, erlaubt es dem Organismus also, seine Aktivitaäten an den Zyklus seiner Umwelt anzupassen.
- Die innere Uhr ist bei manchen Organismen an der Orientierung an­hand des Sonnenstandes beteiligt. Hierfür ist eine genaue Schätzung der Tageszeit wichtig.
- Sie liefert eine Schätzung der Tages- bzw. Nachtlange, sodass saisonale Phänomene, die von der Jahreszeit abhängen, korrekt reguliert werden können (15).

Entrainment ist temperaturkompensiert (28). Da die Außentemperatur zu­meist nicht konstant ist, waährend die Geschwindigkeit biochemischer Prozes­se temperaturabhaänig ist, wird durch die Temperaturkompensation ein Aus­gleich geschaffen — die circadiane Uhr des Organismus läuft nicht schneller oder langsamer, wenn sich die Temperatur innerhalb eines physiologischen Bereiches ändert.

Der am häufigsten von Organismen zum Entrainment genutzte Stimulus ist der Licht-Dunkel-Wechsel, es gibt jedoch auch andere Umweltfaktoren, die als Zeitgeber dienen koännen. Hierzu gehoären zum Beispiel die Temperatur, Feuchtigkeit, Verfägbarkeit von Nahrung und soziale Hinweise. Derzeit ist noch nicht vollständig klar, wie wichtig der Einfluss dieser Stimuli ist. Licht beeinflusst nicht nur die Phase, sondern auch die Periode und Amplitu­de circadianer Rhythmen. In einer konstant hellen Umgebung (Light Light, LL) hängt die Periode der inneren Uhr sehr stark von der Intensität des Lich­tes ab. Bei tagaktiven Wirbeltieren fährt eine Steigerung der Lichtintensität zudem meist zu einer Beschleunigung der Rhythmen, bei nachtaktiven Wir­beltieren zu einer Verlangsamung. Diese Korrelation ist als Aschoffs Regel bekannt (29).

Es gibt zwei Modelle, um Entrainment zu erklaren, das kontinuierliche und das diskrete. Das kontinuierliche Modell basiert auf Aschoffs Beob­achtung, dass die FRP von der Lichtintensität abhängt. Nach diesem Mo­dell veraändert die biologische Uhr im Laufe eines Tages staändig ihre Pe­riode in Abhängigkeit von der aktuellen Lichtintensität, sodass schließlich ein Entrainment erreicht wird. Das diskrete Modell wurde von Pittendrigh eingefährt. Es ist als Mittel zur Vorhersage des Entrainments bei einigen Organismen sehr erfolgreich, vor allem bei Drosophila und bei nachtak­tiven Nagetieren (26). Nach diesem Modell befindet sich der circadiane Schrittmacher im Gleichgewicht mit einem Zeitgeber, der aus einem Licht­Dunkel-Zyklus (Light Dark, LD) von wiederholten Lichtpulsen besteht. Die­ses Gleichgewicht tritt ein, wenn jeder Lichtpuls eine Phasenverschiebung bewirkt, die exakt dem Unterschied zwischen der FRP und der Periode des entrainierenden Zyklus entspricht. In der Natur sind dies Morgengrauen und Abenddäammerung. Diese Uä bergäange käonnen im Labor durch kurze Licht­pulse simuliert werden.

Obwohl das diskrete Modell das Verhalten der circadianen Uhren vieler Or­ganismen gut vorhersagt, gibt es einige Aspekte circadianer Rhythmen, die durch das kontinuierliche Modell besser beschrieben werden. Setzte man Or­ganismen läangere Zeit einer Photoperiode aus, welche nur aus regelmaäßigen Lichtpulsen alle 12 Stunden bestand („Skelett-Photoperiode"), so kam es zu einem Sprung in der Phasenverschiebung (26). Die Vermutung liegt nahe, dass ein kontinuierlicher Einfluss des Lichtes in der Natur solche Spränge verhindert. Ein drastischeres Beispiel ist das Verhalten tagaktiver Ziesel. Bei diesen findet Entrainment statt, ohne dass sie jemals Lichtpulse im Morgen­grauen oder in der Abenddäammerung erhalten. Es ist also wahrscheinlich, dass ein integriertes Modell, das sowohl das kontinuierliche als auch das dis­krete Modell beruäcksichtigt, besser zur Erklaärung des Entrainments geeignet ist.

Kapitel 3 Analyse des dynamischen Verhaltens biochemischer Reaktionsnetzwerke

3.1 Modellierung mittels Differentialgleichungen

Da die im Abschnitt 2.2 beschriebenen Mechanismen auf molekularer Ebe­ne stattfinden, lassen sich auch mathematische Methoden, die urspruänglich zur Beschreibung und Analyse chemischer Reaktionen entwickelt wurden, in diesem Bereich anwenden.

Ein sehr haäufig verwendeter Ansatz ist die Modellierung mithilfe von Diffe­rentialgleichungen. Dabei verwendet man den Begriff des Reaktionssystems: Ein Reaktionssystem beinhaltet ein biochemisches Reaktionsnetzwerk und das dynamische Verhalten dieses Netzwerkes (30). Ein Reaktionsnetzwerk ist die Vereinigung einer Menge von Spezies, Molekuälen gleicher Struktur, und einer Menge von Regeln, nach denen diese Spezies miteinander reagie­ren. Durch den Sammelbegriff Spezies wird dabei das gesamte Spektrum biologischer Molekuäle abgedeckt: DNA, mRNA, und Proteine ebenso wie Phospholipide oder Glucose. Die Reaktionsregeln beschreiben, welche Stof­fumwandlungen im Netzwerk vorkommen. So ist zum Beispiel die Reaktion ATP — ADP + P unter Freisetzung von Energie mäglich (also die Aufspal­tung des Energietraägers Adenosintriphosphat zu Adenosindiphosphat und Phosphorsaure), nicht jedoch die Reaktion ATP — ADP (zumindest nicht in einem biologischen System, aufgrund des Masseerhaltungssatzes). Das dynamische Verhalten ergibt sich aus dem Stoffumsatz der Reaktionen sowie der Geschwindigkeit, mit der diese Reaktionen stattfinden. Diese Re­aktionsgeschwindigkeit V wird als Kinetik bezeichnet, Einheit der Kinetik ist Stoffkonzentrationsaänderung pro Zeiteinheit; mathematisch darstellen laässt sie sich als

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Die Grundlage aller verwendeten Kinetiken liegen im chemischen bezie­hungsweise physikalischen Verhalten der einzelnen Spezies. Der einfachste Fall ist ein Spezialfall der sogenannten Massenwirkungskinetik, nämlich die irreversible Massenwirkungskinetik (31). Diese kommt auch bei einigen Reaktionen im Modell fär circadiane Uhren vor, das als Grundlage fär die Simulationsstudien in Kapitel 5 dient, und sei deshalb im folgenden genauer erläutert. Hierzu wird in dieser Arbeit als Beispiel das sehr einfache Reak­tionsnetzwerk

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betrachtet. Beeinflusst werden die Geschwindigkeiten der stattfindenden Re­aktionen durch die Faktoren Temperatur, Anfangskonzentrationen und Akti­vierungsenergie. Daraus resultiert die Anzahl der chemisch wirksamen, nich­telastischen Molekälkollisionen. Werden diese Faktoren verändert, andert sich auch die Anzahl der nichtelastischen Kollisionen Z und damit die Ge- schwindigkeit, mit der die Reaktion stattfindet. Fär die Reaktion [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] mit den Konzentrationen A, B und C gelte:

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Die Geschwindigkeit [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] (beziehungsweise in Reaktionssystemen mit mehre­ren Reaktionen j : Vj) setzt sich aus den Substratkonzentrationen A und B sowie einem Proportionalitätsfaktor, der Geschwindigkeitskonstante kj, zusammen. Anhand obigen Beispiels:

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kj beinhaltet die anderen oben genannten Faktoren Temperatur und Aktivie­rungsenergie und lasst sich mathematisch formulieren durch die Arrhenius- Gleichung (32)

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Dabei ist R die allgemeine Gaskonstante,[Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]ist die Boltzmann-Konstante, Na die Avogadrokonstante. Der Faktor K und die Aktivierungsenergie Ea kännen durch Messung approximiert werden. Zudem sind die Temperatur und Konzentrationen messbar, sodass durch Testreihen ein Wert fär kj ermittelt werden kann.

Durch Gleichsetzen von 3.1 und der allgemeinen Form von 3.3 erhalt man fär ein Reaktionsnetzwerk mit r Reaktionen und n Spezies die allgemeine Form

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wobei [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] der stächiometrische Koeffizient der Spezies Si in der Reaktion j mit Si als Edukt und [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] der stochiometrische Koeffizient der Spezies Si in der Reaktion j mit Si als Produkt ist. Am Beispiel des obigen Reaktions­netzwerkes 3.2 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

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Die Lösung des Differentialgleichungssystems beschreibt den Konzentrations-Zeit-Verlauf der beteiligten Spezies. Die Anfangskon­zentrationen, im Beispiel A(0), B(0), C(0) und D(0), werden hierbei vorgegeben.

Oft ist es sinnvoll, das Differentialgleichungssystem F unter Nutzung von Konzepten der linearen Algebra als Produkt aus der stöchiometrischen Matrix N und des Vektors V der Geschwindigkeiten darzustellen (33):

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In der stöchiometrischen Matrix N gehen die einzelnen Metabolite i (Zeilen) mit ihrer Nettomolekölzahl [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] för die vorkommenden Reaktio­nen j (Spalten), ein. Dabei haben verbrauchte Spezies negative und erzeugte Spezies positive Vorzeichen. Der Geschwindigkeitsvektor V enthalt die Ge­schwindigkeiten der einzelnen Reaktionen des Reaktionssystems,

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wobei [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] erneut der stöchiometrische Koeffizient der Spezieskonzentration Si in der Reaktion j mit Si als Edukt ist. För das Beispielsystem 3.2 gilt:

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Wie zu Beginn erwöhnt, handelt es sich bei der irreversiblen Massenwir­kungskinetik jedoch nur um einen Spezialfall; bei keiner der Reaktionen findet eine Röckreaktion statt. Die reversible Massenwirkungskinetik ist in dieser Hinsicht allgemeiner, Reaktionen der Art

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sind möglich. Dabei ist [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] die Geschwindigkeitskonstante der Hinreakti­on, [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] die Geschwindigkeitskonstante der Röckreaktion. Gleichung 3.4 und Gleichung 3.5 müssen entsprechend modifiziert werden:

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Die Massenwirkungskinetik ist auf Reaktionen beschränkt, in denen kei­ne Süttigungseffekte auftreten. In der Biochemie treten Süttigungseffekte jedoch hüufiger auf als in der anorganischen Chemie, da viele Reaktionsge­schwindigkeiten durch Enzyme veründert werden. Der Einfluss von Enzymen lüsst sich durch die Michaelis-Menten- und die Hill-Kinetik gut model­lieren.

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Bei der Michaelis-Menten-Kinetik katalysiert ein Enzym E den Umsatz des Substrates S zu einem Produkt P. Dabei gibt es einen Zwischenschritt, in dem S und P den Enzymsubstratkomplex ES bilden. Dieser Zwischenschritt hat eine spezifische Halbsüttigungskonstante Km, die die Substratkonzen­tration angibt, bei der die Halfte der maximalen Umsatzgeschwindigkeit erreicht wird. Sind die Bindungsstellen aller an der Reaktion beteiligten En­zyme besetzt, so kann die Katalyseleistung nicht weiter verbessert werden, und die spezifische Sattigung ist erreicht. Das Reaktionssystem

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kann mit dem Geschwindigkeitsgesetz

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beschrieben werden. Der Verlauf des Graphen ist hyperbolisch (siehe Ab­bildung 3.1). Bei manchen Reaktionen wirkt das Enzym hemmend. Eine Modellierung, die die Inhibition der Reaktion beinhaltet, ist möglich; die Hemmung kann kompetitiv, nichtkompetitiv oder unkompetitiv sein und re­versibel oder irreversibel. Die Hemmung verhindert, dass die maximale Um­satzgeschwindigkeit des Enzyms erreicht wird. Als Beispiel sei die Kinetik für die gemischte, irreversible Hemmung angeführt.

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• Hochschule: Friedrich-Schiller-Universität Jena
• Autor: Benedict Schau (Autor:in)
• Erscheinungsjahr: 2011
• Seiten: 89
• Katalognummer: V174212
• ISBN (eBook): 9783640947591
• ISBN (Buch): 9783640947447
• Sprache: Deutsch
• Schlagworte: reverse-engineering, oszillationssysteme, frequenzregelkreise, nachlaufsynchronisation