Identifizierung von mit HMGA2 interagierenden Proteinen

Tesis , 2009 , 100 Páginas , Calificación: 1,9

Biología - Genética / Ingeniería genética

Das HMGA2-Protein gehört zur Familie der HMG-Proteine (High Mobility Group-Proteine), welche ihren Namen aufgrund der hohen Laufgeschwindigkeit in der Polyacrylamidgelelektrophorese erhalten hat (Tallini u. Dal Cin, 1999). HMG-Proteine wurden 1973 von Goodwin et al. erstmals entdeckt und beschrieben. Sie sind Chromatin assoziierte Nicht-Histon-Proteine, die als architektonische Transkriptionsfaktoren an AT reiche Regionen der DNA binden können (Bustin u. Reeves, 1996). HMG-Proteine können den Aufbau von Kernprotein-Strukturen, welche an der Transkription, der Replikation sowie der Chromatin-Konformation beteiligt sind, beeinflussen. Dies geschieht mit Hilfe eines komplexen Netzwerks von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen (Ferguson et al., 2003). Aufgrund ihrer Funktion als Transkriptionsregulatoren spielen HMG Proteine eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl von Erkrankungen, die auf Mutationen beruhen, welche die chromosomalen Regionen der entsprechenden Proteine betreffen. HMG-Proteine zeichnen sich durch einige gemeinsame chemische und physikalische Eigenschaften aus. Sie können vom Chromatin mit 0,35 M NaCl extrahiert werden, besitzen eine molekulare Masse kleiner als 30 kDa, sind löslich in 5% Perchlorsäure sowie Trichlorsäure und weisen einen hohen Anteil an geladenen Aminosäuren auf (Johns, 1982; Cleynen u. Van de Ven, 2007). Die Familie der HMG-Proteine besteht aus den drei Subfamilien A, B und N, die sich aufgrund charakteristischer, funktioneller Sequenzmotive voneinander unterscheiden (Catez et al., 2004; Flohr et al., 2003; Prymakowska-Bosak et al., 2001). Die Interaktion zwischen HMG-Proteinen und DNA bzw. Chromatin erfolgt mit Hilfe dieser Sequenzmotive. Bezeichnend für die jeweilige Bindungsdomäne ist der letzte Buchstabe der Subfamilien. Die Bindungsdomäne der HMGA-Proteine ist der so genannte AT-Hook, die HMG-Box ist die Bindungsdomäne der HMGB-Proteine und die nukleosomale Bindungsdomäne ist charakteristisch für HMGN-Proteine (Bustin, 1999).
Die HMGN-Subfamilie umfasst die Proteine HMGN1, HMGN2, HMGN3a, HMGN3b und HMGN4, wobei HMGN3a und HMGN3b alternative Splicevarianten sind. Diese Proteine werden ubiquitär exprimiert. Indem sie an die Innenseite nukleosomaler DNA binden, beeinflussen die HMGN-Proteine die Interaktion zwischen DNA und dem Histonoktamer (Bustin u. Reeves, 1996; Shick et al., 1985). HMGN-Proteine besitzen eine so genannte Chromatin-Aktivierungsdomäne, die ihnen die Fähigkeit verleiht, das Chromatin...

Inhaltsverzeichnis

• Abkürzungsverzeichnis
• Einleitung
• Materialien
  • Geräte und Verbrauchsmaterialien
  • Chemikalien
  • Lösungen und Puffer
  • Medien
  • Hefestämme
  • Bakterienstämme
  • DNA-Molekulargewichtsmarker
  • Primer
  • Vektoren
  • Kits
  • Enzyme
  • Software
• Methoden
  • Kultivierung von Prokaryoten
    • Kultivierung von Prokaryoten auf Agarplatten
    • Flüssigkulturen von Prokaryoten
    • Anlegen von Glycerolstocks
  • Kultivierung von Eukaryoten
    • Kultivierung von Eukaryoten auf Agarplatten
    • Flüssigkulturen von Eukaryoten
  • Isolierung von Plasmid DNA aus Prokaryoten
    • Plasmid Midiprep mittels QIAGEN® Plasmid Midi Kit
    • Plasmid Maxiprep mittels QIAGEN® Plasmid Maxi Kit
    • Schnelle DNA-Isolierung
  • Isolierung von Plasmid DNA aus Eukaryoten
    • DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAprep® Spin Miniprep Kit
    • DNA-Isolierung aus S. cerevisiae mittels QIAGEN® Plasmid Mini Kit und Lyticase
  • Konzentrations- und Reinheitsbestimmung
    • Konzentrations- und Reinheitsbestimmung mittels Photometrie
    • Konzentrationsbestimmung mittels Agarose-Gelelektrophorese
  • Restriktionsverdau
    • Restriktionsverdau zum Qualitätstest von Plasmiden
    • Restriktionsverdau zur Klonierung von DNA-Fragmenten
  • Dephosphorylierung
  • Ligation
  • Agarose-Gelelektrophorese
  • Aufreinigung von DNA aus einem Agarosegel
    • Aufreinigung von DNA mittels QIAquick™ Gel Extraction Kit
    • Aufreinigung von DNA mittels QIAEX® II Gel Extraction Kit
  • PCR-Purification mittels QIAquick™ PCR Purification Kit
  • Transformation in Prokaryoten
    • Herstellung thermokompetenter Bakterien E. coli DH5α
    • Thermotransformation in Prokaryoten
    • Ermittlung der Transformationseffizienz
  • Transformation in Eukaryoten
    • Herstellung kompetenter Hefezellen S. cerevisiae AH109
    • PEG/LIAc-Transformation in Eukaryoten (Gietz et al., 1992)
    • Ermittlung der Transformationseffizienz
  • Polymerase Kettenreaktion
    • Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur mittels Gradienten-PCR
    • PCR zur Überprüfung der PEG/LiAc-Transformation in Eukaryoten
  • Sequenzierung
• Ergebnisse
  • Isolierung von Plasmid DNA und Überprüfung der Vektoren
    • Photometrische Konzentrationsbestimmung isolierter Plasmid DNA
    • Restriktionsverdau zur Überprüfung der Vektoren pGBKT7 und pET-3a-HMGA2
  • Klonierung von HMGA2 in PGBKT7
    • Restriktionsverdau der Vektoren pET-3a-HMGA2 und pGBKT7
    • Ligation des Vektors pGBKT7 mit dem HMGA2-Insert
  • Transformation des Vektors PGBKT7-HMGA2 in E. coli
    • Zählung der gewachsenen Klone und Ermittlung der Transformationseffizienz
    • Restriktionsanalysen des Vektors pGBKT7-HMGA2 nach Schnellprep
    • Photometrische Konzentrationsbestimmung nach Midiprep
    • Restriktionsverdau nach Midiprep
  • Sequenzierung
  • Transformation des Vektors pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae
    • Ermittlung der Transformationseffizienz
  • PCR-Analysen
    • Gradienten-PCR zur Ermittlung der optimalen Annealing-Temperatur verschiedener Primer
    • PCR zur Überprüfung der Transformation von pGBKT7-HMGA2 in S. cerevisiae
• Diskussion
• Zusammenfassung

Zielsetzung und Themenschwerpunkte

Diese Diplomarbeit befasst sich mit der Identifizierung von Proteinen, die mit dem HMGA2-Protein interagieren. HMGA2 ist ein hochmobiles Gruppenprotein, das an der Regulation der Genexpression beteiligt ist und eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Zellproliferation spielt. Die Arbeit zielt darauf ab, die Interaktions-Partner von HMGA2 zu identifizieren und deren Einfluss auf die Funktion des Proteins zu untersuchen.

• Identifizierung von HMGA2-interagierenden Proteinen
• Untersuchung der Funktion von HMGA2-interagierenden Proteinen
• Analyse des Einflusses von HMGA2-interagierenden Proteinen auf die Genexpression
• Entwicklung von neuen Ansätzen zur Modulation der HMGA2-Aktivität
• Bedeutung der HMGA2-Interaktionen für die Zellentwicklung und -proliferation

Zusammenfassung der Kapitel

Das erste Kapitel dieser Arbeit bietet eine umfassende Einleitung in die Thematik der HMGA2-Protein-Interaktionen. Es werden die Struktur und Funktion von HMGA2 sowie die Bedeutung des Proteins für die Zellentwicklung und -proliferation beleuchtet. Die Kapitel drei und vier beschreiben die Methoden und Ergebnisse der experimentellen Arbeit. Es werden die verwendeten Materialien, Methoden zur Klonierung und Transformation von DNA sowie die Analyse der Interaktionspartner von HMGA2 vorgestellt. Das fünfte Kapitel diskutiert die Ergebnisse und stellt die Bedeutung der gefundenen Interaktionen für die Funktion von HMGA2 in den Kontext.

Schlüsselwörter

HMGA2, Protein-Interaktionen, Genexpression, Zellentwicklung, Zellproliferation, Klonierung, Transformation, Interaktions-Partner, Yeast Two-Hybrid System, Chromatin-Remodeling.

• Universidad: University of Bremen (Zentrum für Humangenetik)
• Calificación: 1,9
• Autor: Dipl.-Biol. Wiebke Gelder (Autor)
• Año de publicación: 2009
• Páginas: 100
• No. de catálogo: V171233
• ISBN (Ebook): 9783640904198
• ISBN (Libro): 9783640904341
• Idioma: Alemán
• Etiqueta: HMGA2, HMG-Proteine, Protein-Protein-Interaktionen, Yeast-2-Hybrid, bait, prey, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli