Mithilfe der Biomineralisation reichern selbst kleine marine Organismen kontrolliert anorganische Bestandteile im Körper an. So akkumulieren Copepoden (Ruderfußkrebse) spezifische Elemente in ihren mandibularen Gnathobasen. Die Gründe für eine solche Anreicherung sind verschieden, resultieren aber immer in einer Optimierung von Materialeigenschaften gezielter Körperregionen. Härte, mechanische Flexibilität, spezifisches Gewicht, Farbe und Haptik sind nur einige Materialeigenschaften, die hierbei eine immense Rolle spielen. Die mandibularen Gnathobasen der verschiedenen Copepoden unterscheiden sich nicht nur hinsichtlich ihrer Morphologie, sondern zudem in der elementaren und chemischen Zusammensetzung des entsprechenden Biomaterials.
Die Taxa der Copepoden bildet eine der artenreichsten aquatischen Lebenswelten überhaupt. Sie spielen innerhalb des marinen Zooplanktons eine entscheidende Rolle, da sie als Primärkonsumenten des Phytoplanktons die Nahrungsgrundlage vieler Meerestiere bilden. Erkenntnisse über die Ernährungsweise der Copepoden innerhalb der pelagischen Nahrungskette können genutzt werden, um deren ökologische Bedeutung für die betreffende Region verstehen zu können.
Um den Stellenwert solcher Biomaterialien besser einordnen zu können, muss eine solche Anreicherung analytisch nachgewiesen werden. Die Vielfalt der möglichen Analysenmethoden ist jedoch aufgrund der mikrometerskaligen Gnathobasen stark limitiert. In einem interdisziplinären Forschungsprojekt wurden mithilfe der Licht- und Rasterelektronenmikro¬skopie (REM), der Elektronenstrahlmikroanalyse mit energiedispersiver Röntgendetektion (ESMA/ EDX), der Protoneninduzierten Röntgenemissionsspektroskopie (PIXE) und der Laserablation-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) mandibulare Gnathobasen von acht ausgewählten Copepodenspezies aus dem Südpolarmeer und der Nordsee untersucht und arten-, sowie geschlechterspezifische Anreicherungen von Si, Al und einigen Nebengruppenelementen nachgewiesen.
Zur Kalibrierung der vorgestellten Analysentechniken wurden tablettierte Referenzstandards verwendet. Die Entwicklung einer Herstellungsmethode für solche matrixangepassten, tablettierten Referenzstandards wird vorgestellt. Die Präparation der Proben, sowie die für die Quantifizierung benötigten Standards waren dabei besondere analytische Herausforderungen.
Inhaltsverzeichnis
Danksagung
1 Einleitung
2 Copepoden
2.1 Morphologie der Gnathobasen von Copepoden
2.2 Copepoden-Spezies
3 Angewandte Analysenverfahren
3.1 Mikroskopie
3.1.1 Lichtmikroskopie
3.1.2 Rasterelektronenmikroskopie (REM)
3.2 Elementanalytik
3.2.1 Röntgenfluoreszenzanalyse (RFA)
3.2.2 Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA)
3.2.3 Partikel-/ Protoneninduzierte Röntgenemissionsanalyse (PIXE)
3.2.4 Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS)
3.2.5 Optische Emissionsspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES)
3.2.6 Methoden zur Herstellung tablettierter Referenzstandards für die Mikrobereichsanalytik
4 Experimenteller Teil und Ergebnisdiskussion
4.1 Präparation der mandibularen Gnathobasen
4.2 Instrumentelle Parameter
4.3 Spezies von Copepoden des Südpolarmeers
4.3.1 Calanoides acutus
4.3.2 Calanus propinquus
4.3.3 Heterorhabdus sp
4.3.4 Metridia gerlachei
4.3.5 Rhincalanus gigas
4.4 Spezies von Copepoden der Nordsee
4.4.1 Acartia tonsa
4.4.2 Centropages sp
4.4.3 Temora longicornis
4.5 Herstellung tablettierter Referenzstandards für die Mikrobereichsanalytik
4.5.1 Evaporation einer Suspension
4.5.2 Kopräzipitation
4.5.3 Bestimmung der Gehalte der hergestellten Referenzmaterialien mit der ICP-OES
4.6 LA-ICP-Massenspektrometrie an carbonatischen und copepodischen Proben
5 Abschlussdiskussion und Ausblick
6 Literaturverzeichnis
7 Anhang
7.1 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen
7.1.1 Spezies von Copepoden des Südpolarmeers
7.1.2 Spezies von Copepoden der Nordsee
7.2 Aufnahmen der PIXE
7.2.1 Calanoides acutus, Weibchen
7.2.2 Calanoides acutus, Männchen
7.2.3 Rhincalanus gigas
7.3 Aufnahmen und Spektren der EDX (ED-ESMA)
7.3.1 Spezies von Copepoden des Südpolarmeers
7.3.2 Spezies von Copepoden der Nordsee
7.4 Tablettierte Referenzstandards
7.4.1 Physikalische Eigenschaften
7.4.2 Elementgehalte
7.4.3 Verfahrensstandardabweichung, Verfahrensvariationskoeffizient, Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze nach DIN 32 645 und DIN 38 402.51
7.5 Chemikalien und Geräte
7.5.1 Verwendete Chemikalien
7.5.2 Verwendete Geräte
Selbstständigkeitserklärung
Danksagung
An erster Stelle bedanke ich mich bei Frau Prof. Dr. Carla Vogt für die Aufnahme in ihren Arbeitskreis und für die Überlassung des überaus interessanten Themengebietes.
Darüber hinaus möchte ich mich bei Dr. Jan Michels vom Zoologischen Institut der ChristianAlbrechts-Universität zu Kiel für die aktive und kollegiale Zusammenarbeit bedanken. Er hat mir wertvolle und einzigartige Einblicke in den marinen Mikrokosmos verschafft.
Bei Frau Prof. Dr. Sigrid Schiel und Herrn Prof. Dr. Boris Koch vom Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung in Bremerhaven bedanke ich mich für das zur Verfügung stellen vieler Interessanter mariner Proben.
Für die umfangreichen PIXE-Messungen am LIPSION in Leipzig möchte ich Herrn Dr. Jürgen Vogt meinen Dank aussprechen.
Herrn Prof. Dr. Bernd Hitzmann danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferats zu dieser Arbeit.
Dem gesamten Arbeitskreis Analytik der Leibniz Universität Hannover danke ich für die wertvolle Unterstützung, fachlicher wie mentaler Natur. Ich freue mich schon auf die nächsten Jahre mit Euch beim Kochen und Filme gucken.
Zudem möchte ich meiner Familie danken, die mich über die Jahre bemerkenswert unterstützt hat und jederzeit Verständnis dafür gehabt hat, wenn ich studienbedingt nur wenig Zeit für Sie hatte. Meinen Eltern, Rosa und Paul, danke ich für die liebevolle Obhut und die finanzielle Unterstützung Ohne Euch wäre mein Studium nicht möglich gewesen.
Zum Schluss möchte ich meiner eigenen kleinen Familie danken, die mir jederzeit zur Seite stand, auch wenn es mal schwierig wurde. Magnus, danke für deine uneingeschränkte Unterstützung bei allem, was ich tue.
1 Einleitung
Die Biomineralisation ist so alt wie das Leben auf der Erde selbst und die damit verbundene Fähigkeit von Organismen anorganische Materialien auf- bzw. einzubauen, ist seit jeher einem Evolutionsprozess unterworfen. Bis heute ist diese Fähigkeit von Labormethoden nicht erreicht worden. Reaktionen bei denen einzigartig kristallisierte Minerale synthetisiert werden oder die Synthese von Verbundstoffen sind nur zwei Beispiele[1]. Allein das Endoskelett des Menschen, die Exosklette von Diatomeen (Kieselalgen) oder die Mundwerkzeuge einiger Crustaceen (Krebstiere) verdeutlichen die Präzision mit der selbst einfache Organismen in der Lage sind mineralisierte Materialien zu synthetisieren [1-3]. Mithilfe der Bioakkumulation reichern sie kontrolliert anorganische Bestandteile im Körper an. Die Gründe für eine solche Anreicherung sind verschieden, resultieren aber immer in einer Optimierung von Materialeigenschaften gezielter Körperregionen[3]. Härte, mechanische Flexibilität, spezifisches Gewicht, Farbe und Haptik sind nur einige Materialeigenschaften, die hierbei eine immense Rolle spielen. Eine detaillierte Beschreibung von Struktur und Form bis in den Nanometerbereich hinein ist eine Grundvoraussetzung, um die Mechanismen in der Biomineralisation zu verstehen.
Selbst kleine marine Organismen besitzen die Gabe der gezielten Biomineralisation. Dabei bildet die Taxa der Copepoden eine der artenreichsten aquatischen Lebenswelten überhaupt. Heute sind über 10000 Copepodenspezies bekannt, die als Teil des Zooplanktons die Seen und Meere dieser Welt besiedeln[4]. Copepoden spielen innerhalb des marinen Zooplanktons eine entscheidende Rolle, da sie als Primärkonsumenten des Phytoplanktons die Nahrungsgrundlage vieler Meerestiere bilden[5]. Erkenntnisse über die Ernährungsweise der Copepoden innerhalb der pelagischen Nahrungskette können genutzt werden, um deren ökologische Bedeutung für die betreffende Region verstehen zu können[6].
Den Mundwerkzeugen der Copepoden fällt bei der Nahrungsaufnahme eine Schlüsselfunktion zu. Mithilfe der Mundwerkzeuge erzeugen die Copepoden Wasserströmungen, so dass Nahrung gezielt zur Mundöffnung der Tiere gelangt, die dann von den anliegenden Gnathobasen zermahlen oder aufgespießt wird und im Anschluss über die Mundöffnung der Copepoden aufgenommen wird [7]. Die Morphologie der mandibularen Gnathobasen ist dabei von der Nahrungsquelle der Tiere abhängig [8]. Die Gnathobasenmorphologie herbivorer, carnivorer oder omnivorer Copepoden unterscheidet sich dabei beträchtlich. Copepoden, die sich hauptsächlich von Phytoplankton, z.B. harten Diatomeen, ernähren, besitzen andere Gnathobasen als jene die sich nur von tierischen Organismen ernähren [9, 10]. Die mandibularen Gnathobasen der verschiedenen Copepoden unterscheiden sich zudem nicht nur durch ihre Morphologie, sondern auch in der elementaren und chemischen Zusammensetzung des entsprechenden Biomaterials. Heute ist bekannt, dass in Abhängigkeit zur Nahrungsquelle viele Copepodenspezies gezielt Silizium in Form von Silikaten in den Zähnen ihrer Gnathobasen einlagern, was zu einer Stabilitätserhöhung dieser Bereiche führen soll[11]. Eine solche Silikateinlagerung ist bislang bei keiner anderen Crustaceengruppe bekannt[12]. Wenige Studien konnten bisher zeigen, dass auch andere Elemente (z.B. Kupfer und Zink) akkumuliert werden[13]. So sollen Kupfer und Zink die Einlagerung von Silizium als Kofaktoren beeinflussen[12]. Erhöhte lokale Konzentrationen sollen eine Stabilitätserhöhung der betreffenden Gnathobasen-Partien bewirken, so dass eine Aufnahme von harten Nahrungspartikeln (z.B. Diatomeen) erst ermöglicht wird, ohne dass die Zähne oder die Gnathobase bei der mechanischen Beanspruchung beschädigt werden [9, 13].
Um den Stellenwert solcher Einlagerungen für die Copepoden besser einordnen zu können, muss die Akkumulation solcher Elemente zuerst analytisch nachgewiesen werden. Viele der bereits bekannten Ergebnisse stützen sich auf qualitative Analysen [11-13]. Für ein gezieltes Verständnis der Vorgänge bei der Biomineralisation an den Gnathobasen der Copepoden ist jedoch eine quantitative Elementanalyse unerlässlich. Die Vielfalt der möglichen Analysenmethoden ist jedoch aufgrund der mikrometerskaligen Gnathobasen stark limitiert. Die zu erfüllenden Randbedingungen der eingesetzten Analysentechniken sind vor allem eine hohe laterale Auflösung und eine hohe Empfindlichkeit. Aufgrund der geringen Abmessung der Gnathobasen und den daraus resultierenden niedrigen Gewichten von teils nur wenigen Mikrogramm sind zudem Analysentechniken mit vorherigem nasschemischem Probenaufschluss (z.B. ICP-MS oder GF-AAS) ungeeignet. Zudem arbeiten solche Techniken nicht ortsaufgelöst und nicht zerstörungsfrei, so dass sie keine Rückschlüsse auf die Elementverteilung oder auf Konzentrationsgradienten der betrachteten Elemente innerhalb der Probe erlauben.
In der Vergangenheit wurden die verschiedensten Analysentechniken verwendet, deren Nachweisgrenzen allerdings stark begrenzt waren. Zur Analyse von Copepoden wurde u.a. die Rasterelektronenmikroskopie (REM) verwendet, oftmals in Verbindung mit einer Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA) bzw. einer energiedispersiven Röntgefluoreszenzanalyse (EDX) [12-14]. Zur Mikrobereichsanalyse an Biomineralisationsprodukten mariner Würmer wurde auch die Mikro-Röntgenfluoreszenzanalyse (µRFA) eingesetzt [15]. Die Nachweisgrenzen sind bei der µRFA niedriger als bei der ESMA/EDX, jedoch ist die laterale Auflösung im Vergleich deutlich schlechter. Sogar Röntgenbeugungsexperimente wurden durchgeführt [14, 15], alle jedoch vor dem Hintergrund der vergleichsweise moderaten Nachweisgrenzen.
Als Festkörper-Analysentechniken mit hoher Ortsauflösung und hoher Empfindlichkeit haben sich die Protonen-/ Partikelinduzierte Röntgenemissionsspektroskopie und die LaserablationsMassenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS) bewährt. Sie erreichen Nachweisgrenzen von wenigen µg/g [16-18] und darunter. Solche Techniken wurden bereits für einige Fragestellungen auf dem Gebiet der Biomineralisation eingesetzt. Um genaue quantitative Analysenergebnisse erhalten zu können, die eine hohe Wiederholrate gewährleisten, können tablettierte Referenzstandards hoher Homogenität verwendet werden, die der Probenmatrix spezifisch angepasst wurden [19, 20]. Diese sollen den eingesetzten Analysentechniken als Kalibrationsstandards dienen[21].
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Mikrobereichsanalyse an Gnathobasen und deren Zahnstrukturen von acht ausgewählten Copepodenspezies aus dem Südpolarmeer und der Nordsee. Hierfür sollen verschiedene Analysenmethoden entwickelt und miteinander verglichen werden. Zur Mikrobereichsanalyse an Gnathobasen werden in dieser Arbeit die Licht- und Rasterelektronenmikroskopie, die Elektronenstrahlmikroanalyse mit energiedispersiver Röntgendetektion und die Protonen-/ Partikelinduzierte Röntgenemissionsspektroskopie verwendet. Ferner sollte eine Methode entwickelt werden, um die Gnathobasen mithilfe der Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma untersuchen zu können. Im Anschluss sollen die Realisierbarkeit und die Grenzen dieser Methode in Bezug auf das vorliegende Analysenproblem diskutiert werden.
Zur Kalibrierung der vorgestellten Analysentechniken wurden tablettierte Referenzstandards verwendet. Die Entwicklung einer Herstellungsmethode für solche matrixangepassten, tablettierten Referenzstandards wird hier vorgestellt und angewendet.
2 Copepoden
Copepoden gehören zur Gruppe der Crustaceen (Krustentiere). Sie sind ein Hauptbestandteil des marinen Zooplanktons und bilden damit als Primärkonsumenten des Phytoplanktons einen Grundstein der Nahrungskette des marinen Ökosystems[5]. Das Zooplankton lässt sich in zwei Hauptgruppen einteilen, in die Protozoa (Einzeller) und die Metazoa (Vielzeller). Zu ersterer gehören u.a. Rhizopoda, heterotrophe Flagellaten und Ciliaten, zur zweiten Gruppe Rotatorien, Cladoceren und die hier gezeigten Copepoden[4]. Die Klasse der Copepoden lässt sich in zehn Ordnungen unterteilen. Platycopioida, Calanoida, Mormonilloida, Poecilostomatoida, Siphonostomatoida, Misophrioida, Cyclopoida, Monstrilloida, Harpacticoida und Gelyelloida [22]. Sie unterscheiden sich vor allem durch ihre unterschiedliche Körperform. Calanoida besitzen die längsten Antennen innerhalb der Klasse der Copepoden, die sie zur Fortbewegung als auch zur Sinneswahrnehmung verwenden. Ihr Vorderkörper und ihr Abdomen (Hinterleib) lassen sich gut voneinander trennen. Im Gegensatz dazu besitzen beispielsweise Cyclopoida und Harpacticoida relativ kurze Antennen und teils eine deutliche Körperdreiteilung[4]. Die in dieser Arbeit untersuchten Copepoden gehören der Klasse der Calanoida an.
Die Körper der Copepoden sind segmentiert. Neben dem ersten langen Antennenpaar besitzen sie weitere Extremitäten, wie beispielsweise ein verkürztes zweites Antennenpaar, Maxillen oder Maxillipeden. Copepoden bewegen sich hauptsächlich durch Schlagen ihrer Füße und Antennen fort. Ihre Lebensdauer beträgt im Durchschnitt zwischen 6 und 13 Monaten[23].
2.1 Morphologie der Gnathobasen von Copepoden
Die Gnathobasen (von Gnathos = altgriech. Kiefer) gehören zu einer Reihe von paarigen Mandibeln (Ober-/Unterkiefer bei Gliederfüßern) an der ventralen Seite der Copepoden. Sie liegen rechts- und linksseitig der Mundöffnung und dienen den Copepoden als Mundwerkzeuge[24]. Die Mandibeln setzen sich dabei aus verschiedenen Teilen zusammen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, bestehen sie aus einer Basis, einem Exopoditen, einem Endopoditen und der bereits erwähnten Gnathobase mit angrenzender Coxa, die direkt am Körper der Tiere anliegt. An der Mundöffnung wird der distale Teil der Gnathobase teilweise vom Labrum überdeckt (vgl. Abb. 2)[25].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 1: rechte Mandibel von Paraeuchaeta Antarctica von cranial. Endopodit (En), Exopodit (Ex), Basis (B), Coxa (Co), Gnathobase (Gn)[25]
Die Gnathobase selbst geht am proximalen Ende über ein drehbares Gelenk an der Coxa in die Basis über, von der je ein Exopodit und ein Endopodit abgehen (vgl. Abb. 1). Als Exo- und Endopodite werden bei Crustaceen (Krebstieren) allgemein besonders ausgebildete Beinpaare, sog. Spaltbeine, bezeichnet[26]. Am distalen Teil endet die Gnathobase mit einer zahnartigen Struktur. Diese Strukturen werden auch einfach nur Zähne genannt. Wie in dieser Arbeit noch gezeigt wird, sind sie bei jeder Copepoden-Spezies unterschiedlich stark ausgeprägt. Eine unterschiedlich starke Ausprägung zeigt sich (cr) aber auch innerhalb einer Spezies zwischen beiden Geschlechtern.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 2: Ansicht der Mundöffnungsregion auf der Ventralseite von Microcalanus pygmaeus. Linke und rechte Gnathobase (Gn li/re), Labrum (La), linke und rechte zweite Maxillen (Mx 2 li/re), caudal (ca), cranial[25]
Die Zähne der Gnathobasen verlaufen dabei in dorso-ventraler Richtung. Die Gnathobasen selbst besitzen eine craniale und eine caudale Fläche, wobei sie schaufelähnlich aufgebaut sind (vgl. Abb. 2). Wie in Abbildung 3 zu erkennen ist, besitzt jede Copepode eine linke und eine rechte Gnathobase, die sich an ihrem distalen Ende gegenüberstehen.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 3: REM-Aufnahme des Gnatho- basen-Paars eines Rhincalanus gigas- Weibchens von cranial[25]
Der überwiegende Teil der Copepoden besitzt dabei unterschiedlich stark ausgeprägte Zähne, die sich in systematische Zahngruppen einteilen lassen. So besitzen viele Spezies einen ventralen Zahn, mehrere zentrale und dorsale Zähne. Oft schließt die Zahnreihe mit einer dorsalen Borste ab. Der ventrale Zahn ist typischerweise der verhältnismäßig längste Zahn, der auf einem ausgeprägten Sockel aufbaut[4]. Den dorsalen Zähnen auf der cranialen als auch auf der caudalen Seite vorgelagert befindet sich eine Reihe von kleinen Borsten, die der Ortung von Nahrungspartikeln und Fraßfeinden dienen[27].
Die Copepoden durchlaufen in ihrer Entwicklung verschiedene Metamorphosestadien. Sie unterteilen sich in sechs Naupliusstadien und fünf Copepodidstadien, wobei das Copepodidstadium V, dem adulten Stadium entspricht. Die Zahnstruktur ändert sich innerhalb der Copepodidstadien kaum, unterscheiden sich aber deutlich von denen der Naupliusstadien. Die Napliusstadien werden auch Larvenstadien genannt[24].
2.2 Copepoden-Spezies
Die in dieser Arbeit untersuchten Mandibel-Gnathobasen stammen von Copepodenspezies des Südpolarmeeres und der Nordsee. Im Einzelnen sind dies die antarktischen Spezies Calanoides acutus, Calanus propinquus, Heterorhabdus, Metridia gerlachei und Rhincalanus gigas und als Nordsee-Arten Acartia tonsa, Centropages sp. und Temora longicornis. Alle Mandibel- Gnathobasen stammen von Copepoden des Copepodidstadiums V (kurz C V, adultes Stadium) und dazu noch von weiblichen Exemplaren. Bei der Copepodenspezies Calanoides acutus standen ebenfalls Mandibel-Gnathobasen männlicher Exemplare bereit. Die nachfolgende Tabelle gibt einen kurzen Überblick über die in dieser Arbeit untersuchten Copepodenspezies, ihre Lebensräume, ihr Geschlecht, das Entwicklungsstadium und über ihre spezifische Ernährungsweise.
Tab. 1: Übersicht über die bearbeiteten Copepodenspezies, sowie deren Lebensraum, Geschlecht, Entwicklungsstadium (C V: Copepodidstadium V, adultes Stadium) und Ernährungsweise
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Probennahmen der in der vorliegenden Arbeit verwendeten antarktischen Copepodenspezies fanden während der Expeditionen ANT XIX/5, ANT XIX/6, ANT XXI/2, ANT XXII/2 und ANT XXII/2 (2002-2005) mit dem Forschungsschiff „Polarstern“ des lfred- Wegner-Instituts, Bremerhaven ins antarktische Weddellmeer (Südpolarmeer) statt. Das Forschungsschiff umkreiste dabei das Gebiet des Scotia-Bogens nordöstlich der Antarktischen Halbinsel. Die Probennahme der Copepodenspezies der Nordsee fanden im Frühjahr 2009 vor den Küsten Helgolands statt.
Neben den unterschiedlichen Lebensräumen der Copoden-Spezies unterscheiden sie sich vor allem auch in ihrer Ernährungsweise. Es wird zwischen herbivoren, carnivoren und omnivoren Spezies unterschieden. Herbivore Spezies ernähren sich ausschließlich von pflanzlichen Bestandteilen, wie Phytoplankton. Phytoplankton besteht u.a. aus Kieselalgen bzw. Diatomeen (Bacillariophyta), Grünalgen, Goldalgen, Dinoflagellaten und Cyanobakterien (Blaualgen). Herbivore Copepoden nehmen vorwiegend Diatomeen des Phytoplanktons auf. Carnivore Spezies ernähren sich ausschließlich von Zooplankton. Dies können angefangen bei Protozoa (Einzeller) über kleinere Organismen auch andere Copepoden sein. Omnivore Spezies ernähren sich von Phytoplankton als auch von Zooplankton[24].
Die Ernährungsweise der Copepoden wurde in den verschiedensten Arbeiten näher untersucht. Calanoides acutus ernährt sich demnach überwiegend von Phytoplankton und zu einem kleinen Teil auch von Protozoen[28]. Selbst bei kurzzeitigem Entzug von pflanzlicher Nahrungsquelle zeigten Tiere dieser Spezies keine carnivoren Eigenschaften[29].
Auch Calanus propinquus (Abb. 4) gehört zu den Copepodenarten, die sich überwiegend von Phytoplankton (z.B. Diatomeen) und Protozoen ernähren[30], wie Ergebnisse von Fraßexperimenten zeigten (Abb. 5). Zum Teil ernähren sie sich aber auch von Metazoen[31]. So frisst Calanus propinquus bei Nahrungsreduktion auch kleine Copepodenarten[29].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 4: REM-Aufnahme eines Calanus propinquus-Weibchens, Lateralansicht[25]
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 5: REM-Aufnahme von Kotballen eines Calanus propinquus-Weibchens nach Fraßexperimenten mit Diatomeen[25]
Metridia gerlachei ernährt sich ebenfalls von Phytoplankton, allem voran Diatomeen (Bacillariophyceen)[28]. Bei Fraßexperimenten wurde jedoch herausgefunden, dass Metridia gerlachei-Weibchen auch Eier von Calanoides acutus gefressen haben[32]. So wurden vermehrt Tiere gefangen, die Teile von Crustaceen verdaut haben[30].
Die Spezies Rhincalanus gigas (Abb. 6) ernährt sich ebenfalls omnivor. Tiere dieser Art wurden sowohl mit Teilen von Diatomeen aufgefunden, als auch mit Resten von Crustaceen [30, 33].
Heterorhabdus ernährt sich ausschließlich carnivor. Es wurde beobachtet, dass Exemplare dieser Art andere Copepoden und Protozoen fraßen[34].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 6: REM-Aufnahme eines Rhincal- anus gigas-Weibchens, Lateralansicht[25]
Die in der Nordsee heimischen Copepoden-Spezies Acartia tonsa, Centropages sp. und Temora longicornis ernähren sich herbivor. In allen bislang untersuchten Exemplaren dieser drei Arten wurden bei Fraßexperimenten und im Magen-Darm-Trakt lediglich Überreste von Diatomeen (Bacillariophyceen) gefunden [35-37].
Im Allgemeinen zeigt sich ein Zusammenhang zwischen der Gnathobasen-Morphologie der Copepoden und der Ernährungsweise der jeweiligen Spezies. So ernähren sich die beiden antarktischen Arten Clanoides acutus und Calanus propinquus überwiegend von Phytoplankton. Beide Spezies besitzen kurze und kompakte Zähne, die sie zum Zerbrechen der stabilen Diatomeenschalen auch benötigen[9]. Dabei ist unklar, ob die Copepoden die Nahrung zermahlen oder mit ihren spitzen Zähnen punktuell starken Druck ausüben, um diese aufzubrechen [9, 10]. Spezies die sich carnivor ernähren besitzen dem gegenüber eher lange und spitze Zähne. Mit diesen Zähnen können sie tierische Organismen viel effektiver aufspießen und auseinander reißen[25]. Zudem ist die Anzahl der Zähne meist reduziert. So besitzt die Spezies Heterorhabdus nur zwei sehr lange und spitze Zähne, die ein Aufspießen ganzer tierischer Organismen, z.B. anderer Copepoden, ermöglichen[38]. Einige carnivore Copepoden-Spezies sind deutlich kleiner als die tierische Beute, die sie fangen. Ihre spitzen Mundwerkzeuge ermöglichen ihnen ein Aufschlitzen dieser Zooplanktonorganismen[39]. Die Morphologie der Gnathobasen und ihrer Zähne von omnivoren Copepoden-Spezies stellt eine Zwischenstufe zwischen denen der herbivoren, die sich ausschließlich von Phytoplankton ernähren, und der carnivoren Spezies, die nur tierische Organismen fressen, dar[10]. Lichtmikroskopische und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen konnten belegen, dass Metridia gerlachei dieser Gruppe der Copepoden zuzuordnen ist, die in cranial-caudaler Richtung dünne lange und spitze Zähne besitzen [40, 41].
Die Einstufung der Copepoden-Spezies nach ihrer Ernährungsweise lässt sich nicht nur klassisch empirisch ermitteln, sondern auch mithilfe des sog. Edge Index nach K. Itho auch berechnen. Die anzuwendenden Parameter sind die Anzahl und der Abstand der Zähne, sowie die Höhe des ventralen Zahns [8]. Empirisch und mathematisch ermittelte Ernährungsweisen korrelieren zwar oft, weisen aber zum Teil auch Diskrepanzen auf. So würde Metridia gerlachei mathematisch ermittelt den herbivoren Spezies angehören. Es konnte jedoch empirisch gezeigt werden, dass diese Art als omnivor einzustufen ist, da Überreste von Protozoen im Magen-Darm-Trakt dieser Tiere gefunden wurden [25].
Die männlichen Tiere von Calanoides acutus weisen, wie Abbildung 7 zeigt, stark reduzierte Gnathobasen und Zähne auf. Mit diesen Gnathobasen ist eine Nahrungsaufnahme nur sehr beschränkt möglich, da eine ausgebildete Zahnstruktur komplett fehlt. Es wird vermutet, dass die Nahrungsaufnahme bei Männchen dieser Art keine Rolle spielt, da sie nur dem Ziel der Fortpflanzung mit den Weibchen dienen [42, 43]. Es wurde eine stark erhöhte Zahl von Chemorezeptoren
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Abb. 7: REM-Aufnahme einer reduzierten rechten Gnathobase eines Calanoides acutus-Männchens von cranial
an den proximalen Abschnitten der ersten Antennen und Mandibeln der Männchen dieser Art gefunden, die nur noch dazu dienen Pheromone der Weibchen in Wasserströmungen wahrzunehmen. Damit wird ein Auffinden von Weibchen zu Fortpflanzungszwecken stark erleichtert[42]. Zudem könnte die Produktion von Eiern mehr Energie von den Weibchen erfordern als die Produktion von Spermatophoren durch die Männchen[25]. Ferner sind die Weibchen auf genügend Nahrung bei der Reproduktion angewiesen, so dass eine Reduktion der Gnathobasen bei den Männchen ein Grund dafür ist, weshalb es zu keiner Nahrungskonkurrenz zwischen den beiden Geschlechtern kommt und den Weibchen somit größere Nahrungsmengen zur Verfügung stehen[44].
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 8: Strukturformel des Biopolymers Chitin
Die Materialzusammensetzung innerhalb der Mandibel-Gnathobasen ist sehr unterschiedlich. Wie bei den Crustaceen üblich besteht der Panzer aus Chitin, einem Biopolymer (siehe Abb. 8)[24]. Es ist ein farbloses aminozuckerhaltiges Polysaccharid, dessen polymere Kettenlängen stark variieren können und damit auch dessen physikalischen und chemischen Eigenschaften, z.B. Löslichkeit, Zugfestigkeit und Härte.
Die Gnathobase selbst besteht ebenfalls aus Chitin[23]. Die Zähne am distalen Ende der Gnathobase bestehen oft aus mineralisiertem, silikathaltigem Material, was bereits 1954 beobachtet und untersucht wurde[45]. Die Gnathobasen- Zähne sind demnach mineralisierte Gebilde, die sockelartig auf dem Exoskelett aufsitzen. Später wurde diese Erkenntnis untermauert, als festgestellt wurde, dass die Zähne entweder Modifikationen der Chitinoberfläche oder Vorsprüngen aus Chitin entsprächen, die kronenförmig
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 9: Lichtmikroskopische Aufnahme einer rechten Gnathobase eines Rhincalanus gigas-Weibchens mit von cranial
Silikat umschlossen wurden[13]. Weiterhin konnte bei Häutungszyklen beobachtet werden, dass neue Zähne unterhalb der alten Zähne gebildet werden, die zuerst im distalen Bereich und später erst im proximalen Teil der Zähne mit opalinem Silikat überzogen werden (vgl. Abb. 9)[12]. Bislang wird davon ausgegangen, dass es zwischen dem Silikat und dem Chitin keine stabilen Verflechtungen gibt, da Brüche (bedingt durch die Probenpräparation) oft zwischen dem Zahnmaterial und dem Chitin zu sehen waren und als mögliche Schwachstellen in der Gnathobasenstruktur interpretiert wurden[25].
Die Stabilität der Gnathobasen spielt nicht nur bei der Probenpräparation eine wichtige Rolle, sondern vielmehr bei der Zerkleinerung von pflanzlichen und/ oder tierischen Organismen für die Ernährung der Copepoden. Gnathobasen carnivorer und herbivorer Copepoden müssen unterschiedliche Stabilitäten aufweisen, da ihre Nahrungsquelle eine andere ist[11]. Herbivore Copepoden, die sich hauptsächlich von Diatomeen ernähren, müssen deren harte mineralische Silikatschale aufbrechen und in der Lage sein diese auch mit ihren Mundwerzeugen zu vermahlen[12]. Dementsprechend muss die Stabilität der Gnathobasen herbivorer Spezies größer sein, als die Stabilität der Diatomeen. Carnivore Copepoden ernähren sich von tierischen Organismen, u.a. auch von Copepoden selbst[26]. Deren Gnathobasen müssen lediglich in der Lage sein den wesentlich weicheren Chitinpanzer der Organismen aufzubrechen.
Eine Möglichkeit der Stabilitätserhöhung von einzelnen Körperpartien ist allgemein die Einlagerung von anorganischem Material (bzw. Elementen) im Körper. Die Einlagerung von Silizium in Form von Silikat wurde bereits erläutert. Die Natur zeigt auf vielfältige Weise, dass auch die Einlagerung anderer Elemente im Körper zur Stabilisierung führen kann. So lagern Insekten verschiedener Taxa u.a. gezielt Mangan und Zink in ihren Mandibeln ein, um harte Algen oder harte Pflanzensamen aufbohren zu können [46-48]. Aber auch die Einlagerung von Magnetit oder Gips in der Radula (Reibzunge) von marinen Gastropoden (Schnecken) wurde bereits nachgewiesen [49]. Als weiteres Beispiel können die Cheliceren (Kieferklauen) von Spinnen genannt werden, in denen bis zu 15 % Zink nachgewiesen wurden [50].
3 Angewandte Analysenverfahren
3.1 Mikroskopie
Die moderne Mikroskopie ermöglichte dem Menschen Objekte oder Strukturen, deren Größe unterhalb des Auflösungsvermögens des menschlichen Auges lag, zu untersuchen. Die Lichtmikroskopie ist dabei die wohl älteste Technik der Mikroskopie. Sie wurde bereits im 16. Jahrhundert entwickelt. Das zu untersuchende Objekt wird dabei durch eine oder mehrere Glaslinsen vergrößert. Das physikalisch maximal mögliche Auflösungsvermögen eines jeden Mikroskops ist von der Wellenlänge des verwendeten Anregungsmediums abhängig. Neben der klassischen Lichtmikroskopie und der Rasterelektronenmikroskopie, die als Anregungsquelle sichtbares Licht bzw. Elektronen verwenden, gibt es eine Vielzahl weiterer Mikroskopietechniken, die auf anderen physikalischen Anregungsmedien beruhen. Beispiele für Anregungsquellen anderer (rasternder) Mikroskope sind u.a. IR- und Röntgenstrahlung (in IR-bzw. Röntgenmikroskopen), fokussierte Lichtstrahlen mittels Laser (bei Laserrastermikroskopen) oder Ionenstrahlen (bei Focused-Ion-Beam-Mikroskopen), um nur einige zu nennen.
1986 ging der Nobelpreis für Physik an Ernst Ruska, Gerd Binnig und Heinrich Rohrer für Ihre bahnbrechenden Arbeiten auf dem Gebiet der Elektronenoptik und dem Bau des ersten Transmissionselektronenmikroskops und des ersten Rastertunnelmikroskops in den 30er bzw. 80er Jahren des vergangenen Jahrhunderts. Seither ist die Elektronenmikroskopie aus der Wissenschaft nicht mehr wegzudenken.
Im Folgenden wird auf die verwendeten Methoden der Licht- und der Rasterelektronenmikroskopie eingegangen.
3.1.1 Lichtmikroskopie
Lichtmikroskope sind die ältesten und klassischen Geräte zur vergrößerten Darstellung von kleinen Objekten. Als Erfinder des ersten Lichtmikroskops werden häufig der niederländische Brillenmacher Hans Janssen und sein Sohn Zacharias Janssen genannt, die im Jahr 1590 ein solches Gerät gebaut haben sollen. Das Prinzip der Vergrößerung durch diverse Medien ist aber schon viel länger bekannt. Bereits die Römer der Antike beschrieben Vergrößerungen durch mit Wasser gefüllte Glasschalen.
Es gibt die verschiedensten Gerätetypen von Lichtmikroskopen. Im Folgenden werden die drei verwendeten Gerättypen beschrieben: das Auflichtmikroskop und als Unterarten das Stereomikroskop und das Polarisationsmikroskop.
Bei der Auflichtmikroskopie wird die Probe aus Richtung des Objektivs beleuchtet. Das am Präparat reflektierte Licht wird wiederum vom Objektiv aufgefangen. Das Objektiv erzeugt ein reelles Abbild der Probe, welches mithilfe des Okulars vergrößert werden kann. Im einfachsten Fall besteht das Mikroskop aus diesen zwei Linsensystem. Die Vergrößerung aus dem Objektiv und die Vergrößerung aus dem Okular ergeben als Produkt die Gesamtvergrößerung des Mikroskops. Jedoch ist die Mikroskopauflösung nach den Gesetzen der Physik (genauer der Wellenoptik) durch die Größe der Wellenlänge der Anregungsstrahlung limitiert. Im Idealfall beträgt das Auflösungsvermögen der klassischen Lichtmikrokopie maximal 200 nm.
Diese Grenze wird auch als Abbe-Limit bezeichnet:
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Probleme klassischer Lichtmikroskope sind zum einen die starke Limitierung des Auflösungsvermögens und zudem eine eingeschränkte Schärfentiefe. Die Schärfentiefe ist ein Schärfenbereich auf der Probe, der genügend scharf abgebildet wird. Moderne Digitalmikroskope umgehen dieses Problem indem bis zu 50 oder mehr Aufnahmen der Probe in verschiedenen Brennpunktebenen gemacht werden, die anschließend mit geeigneter Software miteinander kombiniert werden, so dass nur die fokussierten Bereiche jedes Einzelbildes zum Gesamtbild beiträgt. Eine solche Funktion wird auch als sog. Tiefenzusammensetzung bezeichnet.
Ein Stereomikroskop besitzt zwei getrennte Strahlengänge mit jeweils Objektiv und Okular, so dass je ein menschliches Auge in je einen Strahlengang blickt. Die Probe wird aufgrund der getrennten Strahlengänge von zwei verschiedenen Winkeln aus beobachtet, wodurch der Eindruck eines dreidimensionalen Sehens erweckt wird. Die Strahlengänge sind um einen Stereowinkel von 14° bis 16° zueinander gekippt, was dem Konvergenzwinkel beider Augen bei Nahakkommodation entspricht.
Bei der Lichtmikroskopie können verschiedene Filter eingesetzt werden, um das Spektrum des Lichts teilweise einzuschränken und somit bessere Kontraste auf der Probe zu erzielen.
Weiterhin besteht die Möglichkeit Polarisationsfilter einzubauen, wie es beim Polarisationsmikroskop der Fall ist.
Ein klassisches Lichtmikroskop kann durch einen geeigneten Polarisationsfilter zum Polarisationsmikroskop erweitert werden. Beim Polarisationsmikroskop wird polarisiertes Licht zur Abbildung verwendet. Abbildungen 10 und 11 erklären schematisch das Prinzip eines Polarisationsmikroskops. Ein Polarisationsfilter (der Polarisator) lässt nur Licht, das in einer Schwingungsebene schwingt, durch. Beim Polarisationsmikroskop werden zwei solcher Polarisatoren verwendet. Ein Polarisator polarisiert das Licht, welches am Objekt reflektiert wird. Ein zweiter wird hinter dem Objektiv installiert. Anisotrope Objekte vermögen die Schwingungsebene des polarisierten Lichts zu drehen. Im günstigsten Fall steht der zweite Polarisator so zur Schwingungsebene des reflektierten, polarisierten Lichts, dass er einen Teil hindurch lässt. Isotrope Objektflächen werden schwarz abgebildet, da sie die Schwingungsebene des polarisierten Lichts nicht drehen können.
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Abb. 10: Prinzip des Polarisationsmikroskops ohne Objekt.Bild: R. Ziel, 2008
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Abb. 11: Prinzip des Polarisationsmikroskops mit Auf- hellung durch doppelbrechendes Objekt. Bild: R. Ziel, 2008
3.1.2 Rasterelektronenmikroskopie (REM)
Seit der Einführung im Jahre 1965 ist das Rasterelektronenmikroskop (REM) aus der modernen Forschung nicht mehr wegzudenken. Die seither große Popularität dieses Messinstruments hat verschiedene Gründe, die auf den Vorteilen dieser Messtechnik beruhen. Das REM besitzt zum einen eine große Schärfentiefe. Im Vergleich zum bereits beschriebenen Lichtmikroskop kann diese beim REM um den Faktor 400 größer sein. Bei gleicher Vergrößerung resultiert daraus eine viel größere Informationsdichte als beim Lichtmikroskop. Zum anderen ist das Auflösungsvermögen des REM um den Faktor 500 größer, so dass die Probe viel stärker vergrößert werden kann. Der breite Vergrößerungsbereich von 10 x bis 500 000 x ermöglicht eine viel größere Anzahl an Anwendungsmöglichkeiten als es beim Lichtmikroskop der Fall ist. Der maximale theoretische Vergrößerungsfaktor liegt bei ca. 1 000 000 x, dabei wird ausgenutzt, dass Elektronen eine kleinere Wellenlänge haben als sichtbares Licht.
Die Beziehung zwischen der Wellenlänge und der Energie bzw. der angelegten Beschleunigungsspannung wird durch das Gesetz nach de Broglie beschrieben:
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Zur Erzeugung des Elektronenstrahls wird eine Elektronenquelle benötigt. Die Elektronenquelle wird auch als Elektronenkanone bezeichnet. Sie besteht aus einer Wehnelt-Anordnung und einer Anode. In den heute verwendeten Rasterelektronenmikroskopen kommen üblicherweise folgende drei Typen von Elektronenkanonen vor: Wolfram-Haarnadelelektrode, Lanthanhexaborid-Kristallelektrode und Feldemissions-Elektrodenkanone. Bei den erstgenannten wird ein Wolframdraht bzw. ein LaB6-Kristall auf einem Wolframdraht zum Glühen gebracht, der dann Elektronen emittiert. Sie zählen daher zu den Glühkathoden.
Eine andere Funktionsweise liegt der Feldemissionskathode zugrunde, die eine Kaltkathoden-Elektronenkanone darstellt. Dabei werden die Elektronen im Hochvakuum durch Anlegen einer
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Abb. 12: Schematischer Aufbau eines Feldemissions-Raster- elektronenmikroskops (FE-REM)
Spannung aus einer Wolframspitze mit sehr kleinem Krümmungsradius herausgezogen. Die erste Anode wird mit einer Spannung von bis zu 2000 V zur Emission der Elektronen aus der Wolfram-Feldemissionskathode genutzt, eine zweite Anode zur Beschleunigung der emittierten Elektronen. Die Verwendung von Feldemissionskathoden bringt einige Vorteile mit sich. Zum einen kann die Helligkeit bis zu tausendmal größer sein als bei herkömmlichen Glühkathoden.
Mit Helligkeit wird oftmals der sog. Richtstrahlwert β bezeichnet. Er gibt den Strahlstrom pro Raumwinkel und abstrahlender Fläche, konstant entlang der optischen Achse, wieder. Dieser Richtstrahlwert (die Helligkeit) ist bei Feldemissionskathoden im Vergleich zu thermischen Emittern um vier Größenordnungen höher[51].
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Zudem ist die Elektronenemission auf einen örtlich sehr kleinen Bereich beschränkt, das heißt, dass sie eine geringe örtliche Streuung besitzen. Bei Glühkathoden emittieren Elektronen aus dem gesamten Glühdraht in verschiedene Raumrichtungen. Zum anderen beträgt die Energiestreuung der emittierten Elektronen nur ein Bruchteil derer der Glühkathoden. Gerade die beiden letztgenannten Vorteile ermöglichen eine weit überlegenere Auflösung der Feldemissionskathode gegenüber herkömmlichen Glühkathoden. Viele Proben können aufgrund der größeren Helligkeit mit deutlich niedrigerer Beschleunigungsspannung untersucht werden. Gerade biologische Proben können mit einem solchen System schonend abgebildet werden. Bei zu hohen Beschleunigungsspannungen treten oftmals Strahlenschädigungen auf. Für ultrahochauflösende REM sind Feldemissionskathoden essenziell, da hiermit Auflösungen von unter 1 nm erreicht werden können. Ein Nachteil ist aber vor allem das benötigte minimale Vakuum von ca. 10-[8] Pa. Glühkathoden benötigen lediglich ein Vakuum von ca. 10-[4] Pa. Zudem sind Geräte mit Feldemissionskathode bedingt durch den komplexen Aufbau wesentlich teurer als jene mit Glühkathode.
Nachdem der Elektronenstrahl die Elektronenkanone durch Anlegen einer Spannung an der Anode verlassen hat und den Wehnelt-Zylinder passiert hat, wird er in einem System aus mehreren Linsen fokussiert. Abbildung 12 stellt schematisch den Aufbau eines RE-Mikroskops dar. Diese Linsen sind Elektromagnete, das heißt, dass die magnetischen Eigenschaften der Linsen durch Änderung des Stromflusses gesteuert werden können. In modernen Rasterelektronenmikroskopen werden leistungsstarke Linsen, sog. Polschuhlinsen verwendet, bei der die magnetischen Kraftlinien innerhalb der Linse auf einen kleinen Spalt konzentriert werden. Zusammen mit der anschließenden Aperturblende fokussieren sie den Elektronenstrahl. Die Aperturblende ist ein Metallstück mit einem runden Loch von 30 bis 1000 µm Größe.
Trifft der Elektronenstrahl nach Passieren der Aperturblende die Probe, so treten verschiedene Wechselwirkungen zwischen Probe und Elektronen auf, wie Abbildung 13 zeigt. Die nachfolgende Abbildung gibt einen kurzen Überblick über die verschiedenen Prozesse und ihre resultierende Rückstrahlung.
Sekundärelektronen (SE) oder Rückstreu- elektronen (RE) sind für die REM die be- deutendsten Strahlungsarten. Beide werden von unterschiedlichen Detektionssystemen registriert und in ein Spannungssignal umgewandelt, so dass die Spannung an eine Ausgabeeinheit weitergeleitet wird. Ein
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Abb. 13: Schematische Darstellung der im REM auftretenden Sekundärstrahlung
Ablenkgerät, welches mit Ablenkspulen an den Objektivlinsen verbunden ist, bewirkt durch Spannungsänderung das zeilenweise Abrastern der Probenoberfläche.
Der einfallende Primärelektronenstrahl kann mit den Atomen der Probe sowohl elastische auch als unelastische Wechselwirkungen eingehen. Elastische Wechselwirkungen finden vor allem zwischen den Primärelektronen (PE) und den Atomkernen der Probe statt, wobei die Elektronen in einem großen Winkel rückgestreut werden. Sie werden auch Rückstreuelektronen genannt. Unelastische Wechselwirkungen treten bei Primärelektronen auf, die auf schwach gebundene Elektronen in den Probenatomen treffen. Die Energie von Sekundärelektronen liegt zwischen 3 bis 5 eV, so dass die SE leicht von der Probe selbst absorbiert werden können, weshalb nur oberflächennahe Elektronen die Probe verlassen können und registriert werden. Dies ist auch die Erklärung dafür, dass SE-REM-Aufnahmen die höchste Auflösung erzielen können. SE werden vom sog. Everhart-Thorney-Detektor detektiert, an dessen Vorderseite ein Faradayscher Käfig installiert ist. An ihm wird eine geringe Spannung von 300 V angelegt, die ein Anziehen der SE bewirkt. Er wird zur Abschirmung des hohen Potentials des Szintillators eingesetzt, so dass die Elektronen des Primärelektronenstrahls nicht von ihm abgelenkt und gestreut werden Vom Faradayschen Käfig eingefangene SE werden dann vom dahinterliegenden Szintillator beschleunigt und beim Auftreffen in Photonen umgewandelt. Über Lichtleiter wird der Lichtimpuls zum Photomultiplier weitergeleitet, der die Photonen in Elektronen umwandelt und vervielfacht. Die Ausgabespannung des Photomultipliers kann dann ausgewertet werden. Das vom Mikroskop standardmäßig ausgegebene Bild wird vor allem aus diesen SE aufgebaut.
Für eine detailreiche topografisches REM Aufnahme sind demnach die Absorption und das Austreten von SE die wichtigsten Faktoren, da kleine Erhebungen auf der Oberfläche zu kürzeren Weglängen führen als auf flachen Ebenen. Bereiche solcher Erhebungen erscheinen bei der REM heller als solche, die flach sind. Dieses Phänomen wird oft auch als Kanteneffekt bezeichnet. Abbildung 14 erläutert diesen Sachverhalt.
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Abb. 14: Wechselwirkungsvolumen des PE-Strahls mit der Probe. SE werden im gesamten Volumen erzeugt, nur die SE des dunkel schraffierten Bereichs können jedoch aus der Probe austreten. a) Viele SE verlassen die Probe (Kanteneffekt), b) Wenig SE verlassen die Probe[52]
Das Wechselwirkungsvolumen, das heißt, jener Bereich der Probe, der zur Streuung der Elektronen im Primärstrahl beiträgt, ist nicht scharf zu begrenzen, da es u.a. von der Dicke und Dichte, der Probenhomogenität und der elementaren Zusammensetzung abhängig ist. Im Idealfall wird dieses Wechselwirkungsvolumen vereinfacht als birnenförmig angesehen. Die Größe dieses Volumens ist wiederum abhängig von den oben genannten Faktoren. Im Allgemeinen wächst das Wechselwirkungsvolumen mit der Stärke der Beschleunigungsspannung und schrumpft mit der mittleren Ordnungszahl der in der Probe enthaltenen Elemente.
Neben der unelastischen Streuung von Elektronen an den Atomen der Probe ist die elastische Streuung von großem Interesse. Über die sog. Rückstreuelektronen (RE) können Rückschlüsse auf die Probenzusammensetzung gezogen werden, da die Austrittstiefe sich im reziproken Verhältnis zur mittleren Ordnungszahl der Probenatome ändert. Dieses Wechselwirkungsvolumen ist bei Rückstreuelektronen viel größer als bei Sekundärelektronen, so dass die mit ihnen erzielte Auflösung geringer ist. Zudem besitzen diese RE-REM- Aufnahmen eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Oberflächentopografie, da die RE eine viel höhere Energie besitzen als SE. Üblicherweise besitzen RE noch 60 bis 80 % der ursprünglichen kinetischen Energie des Primärelektronenstrahls, weshalb sie auch nicht vom Everhart-Thornley-Detektor registriert werden können. Zur Detektion von RE wird ein ringförmiger Halbleiterdetektor oberhalb der Probe in die Vakuumkammer eingebracht. Je nach mittlerer Ordnungszahl der Elemente in der Probe wird der Primärelektronenstrahl wenig oder stark zurückgestreut. Bei einer mittleren Ordnungszahl von 7 werden ca. 5 % der Primärelektronen rückgestreut, bei einer mittleren Ordnungszahl von 47 (Bsp. Silber) werden bereits ca. 40 % der Primärelektronen rückgestreut. Mit RE werden somit Aufnahmen erzeugt, die Rückschlüsse auf die Verteilung von schweren zu leichten Elementen erlaubt. Als problematisch ist aber anzusehen, dass die elastische Streuung nicht nur von der mittleren Ordnungszahl abhängig ist, sondern zudem auch von der Dichte des Materials, die nicht zwangsweise mit der mittleren Ordnungszahl der Elemente in der Probe korrelieren muss.
Abschließend soll nicht unerwähnt bleiben, dass nicht jede Probe mit der REM untersucht werden kann. In vielen Fällen ist eine Probenpräparation notwendig. Zum einen ist die geometrische Abmessung von Untersuchungsobjekten beschränkt. Je nach Geräteausstattung sind Probengrößen von max. 40 mm in Breite, Tiefe und Höhe möglich. Im Normalfall werden deshalb Bruch- oder Teilstücke einer Probe untersucht. Jedoch können nur elektrisch leitende Materialien im REM untersucht
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Abb. 15: Materialstruktur eines beschädigten zentralen Zahns einer gebrochenen rechten Gnathobase des zweiten Exemplars eines Rhincalanus gigas-Weibchens von cranial mit Aufladungseffekten (rot markiert). 2,0 keV, x25000, WD 8,0 mm
werden. Isolatoren, wie Kunststoffe bzw. organische Proben im Allgemeinen, würden sich aufgrund des einfallenden Primärstrahls elektrisch aufladen, da überschüssige Elektronen nicht gleichmäßig abgeleitet werden können. Abbildung 15 zeigt solche Aufladungseffekte (rot gekennzeichnet) bei einer schlecht leitenden mandibularen Probe. Solche elektrisch nichtleitenden Proben müssen daher mit einem elektrisch leitenden Material überzogen oder zumindest auf ein solches aufgebracht werden. Für gewöhnlich wird die Probe auf einem Metallträger platziert. Zur Befestigung des Materials und zur Erhöhung der elektrischen Leitfähigkeit wird vorher eine mit einem dünnen Klebstofffilm überzogene Kohlenstoff- Auflage, das sog. Kohle-Pad oder Graphitklebetab, auf dem Metallträger platziert. Viele elektrisch schlecht- oder nichtleitende Materialien laden sich bei stärkeren Vergrößerungen am Mikroskop trotzallem auf, so dass sie mit einem dünnen elektrisch leitenden Material überzogen werden müssen. Wegen der hohen elektrischen Leitfähigkeit haben sich v.a. Gold, Platin, Palladium oder Mischungen dieser Metalle bewährt. Wie in den folgenden Kapiteln erläutert wird, bringen diese Elemente einen Nachteil mit. Diese schweren Elemente zeigen viele Röntgenfluoreszenzlinien im Spektrum der Elektronenstrahlmikroanalyse (siehe Abschnitt 3.2.2 Elektronenstrahlmikroanalyse), die im ungünstigsten Fall die Röntgen- fluoreszenzlinien der Analyten überlagern können. Daher wird oftmals auch günstiges Graphit zur Beschichtung verwendet, dessen elektrisch leitende Eigenschaften aber deutlich schlechter sind, als die der Edelmetalle. Es gibt einige Beschichtungstechniken. Das Bedampfen oder Besputtern sind nur zwei davon. Die hier untersuchten Proben wurden mit Gold besputtert. Das Sputtern (engl. zerstäuben) ist im Deutschen auch als Kathodenzerstäubung bekannt. Bei diesem physikalischen Vorgang werden Atome aus einem Festkörper, dem Target, durch Beschuss mit energiereichen Ionen (vorwiegend Edelgasionen, wie Argonionen) herausgelöst, welche anschließend auf dem Probenmaterial auskondensieren können. Mit dieser Technik ist die Beschichtung von Proben mit dünnen Metallfilmen im Bereich von wenigen Nanometern möglich.
3.2 Elementanalytik
3.2.1 Röntgenfluoreszenzanalyse (RFA)
Die Röntgenfluoreszenzanalyse (RFA) ist eine der wichtigsten Messmethoden der Materialanalytik. Dies wird dadurch begründet, dass die Probe bei der Messung nicht zerstört wird und somit ein oft aufwendiger Aufschluss entfällt. Zudem können mit der RFA Feststoffe, Flüssigkeiten und Pulver untersucht werden. Die Analysentechnik beruht dabei auf der Anregung von Atomen durch energiereiche Röntgenstrahlung, typischerweise zwischen 20 und 100 keV. Die so angeregten Atome emittieren eine für jedes Element charakteristische Fluoreszenzstrahlung im Röntgenbereich. Die RFA findet eine breite Anwendung, da mit Ausnahme der Elemente Wasserstoff und Helium grundsätzlich alle anderen Elemente des Periodensystems mit der RFA nachweisbar sind. Großer Vorteil der RFA ist, neben der bereits erwähnten zerstörungsfreien Messung, vor allem die Möglichkeit der simultanen Multielementanalyse. Jedoch sind der Analyse Grenzen gesetzt. So sind vor allem quantitative Analysen gegenüber Matrixeffekten störanfällig.
Die Röntgenfluoreszenzspektrometer können in zwei Gruppen eingeteilt werden: energiedispersive (ED-RFA) und wellenlängendispersive (WD-RFA) Geräte. Im weiteren Verlauf wird auf die energiedispersive Variante der RFA näher eingegangen, da nur diese in der vorliegenden Arbeit verwendet wurde.
Der Bereich der zu analysierbaren Elemente mit der ED-RFA reicht von Natrium bis hin zu Uran. Typische Nachweisgrenzen liegen im (sub) ppm-Bereich, wobei die Nachweisgrenzen sich elementspezifisch unterscheiden und das Optimum im Bereich mittlerer Ordnungszahlen liegt.
Röntgenstrahlung kann auf verschiedene Arten mit Materie in Wechselwirkung treten. Dabei wird zwischen Fluoreszenz, sowie Compton- und Rayleigh-Streuung unterschieden. Ein Teil der Röntgenstrahlung, die auf Materie trifft, durchdringt die Materie und wird als transmittierte Röntgenstrahlung abgegeben. Ein anderer Teil der Strahlung wird von der Materie absorbiert und ein weiterer Teil der Strahlung wird rückgestreut, wobei die Rückstreuung mit Energieverlust, als auch ohne stattfinden kann. Rückstreuung mit Energieverlust wird als inkohärente Compton-Streuung bezeichnet, Rückstreuung ohne Energieverlust als kohärente Rayleigh-Streuung. Die absorbierte Strahlung kann als Fluoreszenzstrahlung wieder abgegeben werden. Zudem tritt bei Bestrahlung von Materie mit Röntgenphotonen auch Wärmeentwicklung auf.
Bei der inkohärenten Compton-Streuung wird ein Photon durch Auftreffen auf ein Elektron abgelenkt, wobei ein Teil der Energie auf das Elektron übergeht. Der Grad des Energieverlustes hängt vom Winkel zwischen Elektron und auftreffendem Photon ab.
Bei der Rayleigh-Streuung verbleiben die Elektronen nach der Kollision mit den Photonen in ihrer Atomschale, beginnen jedoch mit der Frequenz des einfallenden Photons zu oszillieren. Bei der Oszillation emittieren die Elektronen wiederum Strahlung der gleichen Frequenz bzw. Energie.
Proben leichter Elementzusammensetzung erzeugen einen hohen Anteil an ComptonStrahlung, da sie verhältnismäßig viele schwach gebundene Elektronen besitzen. Mit steigender Ordnungszahl nimmt der Anteil der Compton-Streuung ab, da die Zahl schwach gebundener Valenzelektronen gegenüber stärker gebundenen Rumpfelektronen verhältnismäßig sinkt. Es verbleibt daher hauptsächlich die Rayleigh-Streuung.
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Abb. 16: Die drei wichtigsten Wechselwirkungen von Röntgenstrahlung mit Materie[53]
Sowohl die Fluoreszenzstrahlung, als auch die Rückstreuung hängen neben der elementaren Materialzusammensetzung auch von der Dicke d und der Dichte ρ des Materials ab (vgl. Abb. 16).
Die Röntgenstrahlung wird beim Durchgang durch Materie mit zunehmender Dicke exponentiell abgeschwächt. Dieser exponentielle Zusammenhang kann, wie folgt, wiedergegeben werden:
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Wird der Schwächungskoeffizient µ auf die Masse bezogen, so wird auch vom Massenschwächungskoeffizienten gesprochen. Der Schwächungskoeffizient µ ist sowohl von der Art des Elements bzw. der elementaren Zusammensetzung abhängig, als auch von der eingestrahlten Wellenlänge bzw. Energie. Die Absorption kann so hoch sein, dass tiefer in der Probe befindliche Elemente nicht mehr von der einfallenden Strahlung erreicht werden können. Oder die charakteristische Fluoreszenzstrahlung aus tieferen Schichten kann die Probe nicht mehr verlassen. Die Anregungstiefe hängt vom Material, der sog. Matrix, als auch von der
Tab. 2: Analysentiefen für drei unterschiedliche Röntgenlinien in verschiedenen Materialien[53]
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Energie der Strahlung ab. In Tabelle 2 sind ungefähre Anregungstiefen in unterschiedlichen Materialien/ Matrices in Abhängigkeit der Anregungsenergie aufgeführt.
Die Fluoreszenz kann klassisch und einfach mit dem Bohrschen Atommodell be- schrieben werden. Abbild- ung 17 zeigt schematisch das Prinzip der Wechselwirkung von einfallenden Photonen auf Probenatome. Trifft Strahlung mit genügender Energie auf ein Atom, können Elektronen aus den Atomschalen
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Abb. 17: Entstehung charakteristischer Röntgenfluoreszenzstrahlung [53]
herausgeschlagen werden (sog. Photoelektrischer Effekt), wobei das Atom in einen instabilen angeregten Zustand höherer Energie übergeht. Die entstandene Leerstelle in der betreffenden, kernnahen Schale, kann durch Transfer eines Elektrons aus einer höheren (äußeren) Schale wieder gefüllt werden. Die Leerstelle wird oft auch initiale Leerstelle oder Primärvakanz genannt. Elektronen äußerer Schalen besitzen allerdings höhere Energien, als diejenigen auf kernnahen Atomschalen, so dass bei diesem Übergang Energie abgegeben wird. Die Energie der so emittierten Photonen liegt in der Größenordnung von 1 bis 100 keV, dem Bereich der Röntgenstrahlung. Als Strahlungsquelle kommt vielfach eine Röntgenröhre zum Einsatz. Außerdem kann auch ein Synchrotron oder radioaktives Material verwendet werden[54]. Es können jedoch auch Elektronen zur Anregung genutzt werden, wie es bei der energiedispersiven Elektronenstrahlmikroanalyse der Fall ist. Zudem ist die Verwendung von anderen Ionenstrahlen, wie hochenergetischen Protonen, möglich. Diese Technik findet bei der Partikel- bzw. Protoneninduzierten Röntgenemission Anwendung.
Die Energie der emittierten Röntgenstrahlung hängt von der Energiedifferenz zwischen der Atomschale der Primärvakanz und der Schale des Elektrons, welches die Schale auffüllt, ab. Da jedes Atom spezifische Energieniveaus aufweist, ist die emittierte Strahlung ein Charakteristikum für jedes einzelne Element.
Das ionisierte und somit angeregte Atom kann allerdings über einen weiteren Weg in den Grundzustand zurückkehren. Die Energiedifferenz zwischen zwei Atomschalen kann auch auf ein weiteres Elektron im Atom übertragen werden, welches anschließend ebenfalls vom Atom emittiert wird. Solche Elektronen werden auch Auger-Elektronen genannt.
Dieser Effekt wird bei der Auger- Elektronenspektroskopie genutzt, nicht aber bei der RFA. Im Gegenteil, die Emission von
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Abb. 18: Emission von Auger-Elektronen und Röntgenfluoreszenz- strahlung als Konkurrenzmechanismen[55]
Röntgenfluoreszenzstrahlung und die Emission von Auger-Elektronen laufen nebeneinander ab, wobei beide Mechanismen miteinander konkurrieren. Abbildung 18 zeigt die Wahrscheinlichkeit einer Auger-Elektronenemssion und der Röntgenfluoreszenz in Abhängigkeit zur Ordnungszahl.
Die Fluoreszenzausbeute ω ist das Verhältnis der Anzahl emittierter Röntgenquanten bzw. Fluoreszenzphotonen nPh einer Serie zu den in der gleichen Zeiteinheit geschaffenen Primärvakanzen n der entsprechenden Schale:
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Die Ausbeuten der unterschiedlichen Schalen sind keineswegs gleich. Vielmehr nimmt die Fluoreszenzausbeute mit der Ordnungszahl zu, so dass für Elemente mit niedrigen Ordnungszahlen geringere Empfindlichkeiten korrelieren. Dies kann auf den verstärkten Auger-Effekt dieser Elemente zurückgeführt werden. Hinzu kommen Streueffekte, die die Fluoreszenzausbeute ebenfalls stark beeinflussen können.
Abbildung 19 zeigt, dass die Fluoreszenzausbeute für sehr leichte Elemente niedrig ist und mit der Ordnungszahl ansteigt. Hier wird auch die Erklärung für die Schwierigkeiten bei der Bestimmung dieser Elemente deutlich und die damit erhöhten Nachweisgrenzen.
Die resultierenden Röntgenspektren be stehen aus der charakteristischen Strahlung des bestrahlten Materials und einer kontinuierlichen Bremsstrahlung. Die Bremsstrahlung resultiert aus dem Abbremsen der Elektronen im elektrischen
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Abb. 19: Fluoreszenzausbeute für K- und L-Elektronen in Abhängigkeit zur Ordnungszahl[53]
Feld der anzuregenden Atome im Targetmaterial der Röntgenröhre. Die Elektronen verlieren beim Abbremsen an kinetischer Energie, was zu einem kontinuierlichen Spektrum führt. Die Röntgenstrahlung ist daher in der Regel polychromatisch. Lediglich bei der Verwendung von Synchrotonstrahlung erfolgt die Anregung meist monochromatisch, da der Geräteaufbau ein Dazwischenschalten von Monochromatoren erlaubt.
Diese Bremsstrahlung kann bei der Auswertung von Röntgenspektren zu Problemen führen, wenn diese die charakteristische Strahlung anderer Elemente überlagert. Das Bremsspektrum primärer Röntgenstrahlung kann mithilfe von Primärstrahlfilter oder Sekundärtargets weitgehend unterdrückt werden.
Ein Spektrometer besteht in der Regel aus Strahlungsquelle, Probe und Detektor. Bei der RFA dient als Strahlungsquelle eine Röntgenröhre. Als Detektionssysteme kommen zwei Varianten zum Einsatz: energiedispersive (ED-RFA) und wellenlängendispersive (WD-RFA) Systeme. Der Unterschied liegt in der Detektionsart. Detektoren von ED-RFA-Systemen messen die Energie der ausgestrahlten Röntgenquanten. Bei WD-RFA-Systemen kommt ein Analysenkristall zur Auftrennung der unterschiedlichen Energien zum Einsatz. Die Röntgenstrahlung wird dabei entsprechend ihrer Energien bzw. Wellenlängen am Kristall gemäß dem Bragg‘schen-Gesetz in verschiedene Richtungen aufgespalten. Ein wichtiger Unterschied ist daher, dass bei WD-RFA- Systemen bewegliche Bauteile zum Einsatz kommen, bei ED-RFA-Systemen hingegen nicht.
Bei einem herkömmlichen RFA-System liegt der Durchmesser der Anregungsfläche der Röntgenstrahlung aus der Röntgenquelle meist bei mehreren Millimetern. Eine Mikroanalyse erscheint somit unmöglich, da die laterale Auflösung zu schlecht ist. Das am Detektor ausgegebene Signal entspricht einem Mittelwert über das gesamte Anregungsvolumen. Um Einflüsse von Inhomogenitäten im Anregungsvolumen zu reduzieren, wird das Probenmaterial oftmals während der Messung zusätzlich gedreht.
Um die Ortauflösung um Größenordnungen zu verbessern, bedient man sich heute sog. Kapillaroptiken. Diese Kapillaroptiken wirken wie ein Linsensystem. Sie fokussieren die Röntgenstrahlung auf einen kleinen Bereich. Kapillarlinsen können aber auch vor dem Detektor installiert werden, so dass die Detektion von Fluoreszenzstrahlung eines kleinen Bereiches ermöglicht wird. Zur Fokussierung der Röntgenstrahlung finden Kapillaren aus leicht gebogenen hohlen Glasfasern Verwendung. Monokapillaren verfügen über eine, Polykapillaren über eine Anzahl an Glasfasern. Die Röntgenstrahlung wird, wie in der nachfolgenden Abbildung gezeigt, in den Fasern reflektiert und anschließend auf einen definierten Punkt konzentriert.
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Abb. 20: Mono- (oben) und Polykapillarlinse (unten)[53]
Mit Hilfe dieser Kapillaroptiken sind heute Durchmesser der Anregungsflächen von 20 bis 300 µm möglich[54]. Aufgrund ihres lateralen Auflösungsvermögens im Mikrometerbereich werden solche Geräte auch als µRFA-Systeme bezeichnet. Für eine noch präzisere Ortsauflösung muss auf eine andere Analysenmethode zurückgegriffen werden: der Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA).
Für eine quantitative Elementanalyse stehen dem Nutzer zwei verschiedene Varianten zur Verfügung: eine standardfreie, als auch eine standardbasierende Methode. Für eine standardbasierende Analyse muss die gesamte Matrix der später zu untersuchenden Probe bekannt sein. Nur wenn die elementare, als auch die chemische Zusammensetzung bekannt ist, kann die Methode mit geeigneten Standards kalibriert werden. Besitzen Standards und Probe unterschiedliche Matrices, so können die Zählraten des Detektors für die Standards nicht mit denen der Proben verglichen werden. Da aufgrund unterschiedlicher Matrices unterschiedliche Massenschwächungskoeffizienten resultieren, ergeben sich trotz gleicher Konzentration eines bestimmten Elements für die Intensitäten der elementspezifischen Röntgenfluoreszenzstrahlung ebenfalls unterschiedliche Werte. Daher ist vielfach eine standardbasierende Messung fehlerbehaftet. Hier bietet die standardfreie Analyse eine mögliche Alternative. Durch Verwendung von Fundamentalparametern ist dies möglich. Hierfür müssen alle relevanten Größen, wie die Eigenschaften der Röntgenröhre, des Targets und des Detektors, Geometrie des Strahlengangs, die Eindringtiefe der Röntgenstrahlen in das Material etc., bekannt sein[56]. Mit leistungsstarken Computern und Programmen lässt sich so eine Matrixkorrektur durchführen, so dass eine quasi-standardfreie Messung möglich ist. Quasi-standardfrei, da zu Beginn mindestens einmal eine Referenzprobe analysiert werden muss. Mit dieser Referenzprobe genau bekannter Zusammensetzung kann am Detektor für jedes enthaltene und detektierbare Element eine Zählrate ermittelt werden. Das Computerprogramm setzt bei der Messung einer unbekannten Probe die ermittelte Zählrate mit der bekannten ins Verhältnis. Mithilfe der Fundamentalparameter und eines Algorithmus kann nun der Gehalt der unbekannten Probe iterativ errechnet werden[56]. Der Nachteil dieser Methode besteht aber in der Tatsache, dass auch hier die Probenzusammensetzung gut bekannt sein muss, um ein Ergebnis mit kleiner Restunsicherheit erhalten zu können. In vielen Fällen ist die Zusammensetzung und damit die Matrix der Probe nicht hinreichend bekannt, so dass standardlos ermittelte Analysenergebnis mit einem erheblichen Fehler behaftet sein können.
3.2.2 Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA)
Die grundsätzlichen physikalischen Gesetzmäßigkeiten der Elektronenstrahlmikroanalyse (ESMA) beruhen, wie schon bei der RFA, auf der Fluoreszenz von Röntgenstrahlung der angeregten Atome. Grundlegender Unterschied ist hierbei jedoch die Anregungsquelle bzw. das Anregungsmedium. Bei der ESMA werden Atome in der Probe durch Elektronen angeregt. Elektronen sind negativ geladene Teilchen, die in einem elektromagnetischen Feld abgelenkt werden können. Sie sind idealerweise monoenergetisch. Das heißt, dass die kinetische Energie der Elektronen mit der eingestellten Beschleunigungsspannung am Gerät korreliert.
Bei der (Mikro-)-RFA werden Röntgenquanten ohne Masse und Ladung zur Anregung verwendet. Die Röntgenstrahlung ist meist polychromatisch und entspricht daher der Energieverteilung eines Anregungsspektrums der Röntgenröhre.
Die Elektronen des primären Elektronenstrahls bei der ESMA werden typischerweise mit einer Beschleunigungsspannung von 5 bis 50 keV beschleunigt. Die so beschleunigten Elektronen treffen auf die Probe und wechselwirken, analog den primären Röntgenstrahlen bei der RFA, auf unterschiedliche Weise mit ihr. Ein Teil der Primärelektronen wird durch das Coulomb-Feld zwischen dem Atomkern und dessen fest gebundenen Elektronen abgebremst und erzeugt so einen spektralen Untergrund, das bereits bekannte Bremsspektrum. Die Energie der einfallenden Primärelektronen muss über der Bindungsenergie der Elektronen in den Probenatomen liegen, damit Elektronen aus der Atomschale entfernt werden können und Röntgenfluoreszenzstrahlung entsteht. Andernfalls können keine Elektronen aus der Atomschale entfernt werden, so dass es zu keiner Röntgenfluoreszenz kommt. Ist die Energie jedoch zu hoch, so treten vermehrt Elektronen in Coulomb-Felder der Probenatome, wodurch letztendlich nur das Bremsspektrum überproportional größer wird und somit der Untergrund stark ansteigt. Um eine ausreichende Fluoreszenzausbeute zu erreichen, wird üblicherweise die doppelte bis dreifache Bindungsenergie der Elektronen in den zu untersuchenden Probenatomen zur Beschleunigung der Primärelektronen angesetzt.
Die ESMA wird umgangssprachlich oft nur kurz als EDX (energiedispersive Röntgenanalyse) bezeichnet. Allerdings kann die resultierende Röntgenfluoreszenzstrahlung, wie bei der RFA, entweder energiedispersiv als auch wellenlängendispersiv analysiert werden. Da bei der REM und der ESMA Elektronen als Anregungsmedium dienen, werden die meisten heute vertriebenen RE-Mikroskope mit einer EDX oder WDX-Einheit ausgestattet. Für die vorliegende Arbeit wurde die energiedispersive Röntgenanalyse (EDX) an einem FE-REM eingesetzt. Mit der EDX können alle Elemente ab einer Ordnungszahl von Z = 4 (Beryllium) nachgewiesen werden, wobei die Nachweisgrenze je nach Ordnungszahl bei bestenfalls 100 µg/g liegt. Dies ist ein Resultat der unterschiedlichen Anregungswahrscheinlichkeiten für Elektronen und Röntgenstrahlung in Abhängigkeit von dem anzuregenden Element. Leichte Elemente werden besser mit Elektronen und schwere Elemente besser mit Röntgenstrahlung angeregt. Zudem sind die Anregungsvolumina beider Verfahren sehr unterschiedlich. Bei der ESMA werden Anregungsvolumina von typischerweise 1 µm³ erzeugt, bei der µRFA jedoch Anregungsvolumina von ca. 1000 µm³ [57].
3.2.3 Partikel-/ Protoneninduzierte Röntgenemissionsanalyse (PIXE)
Zur Erzeugung probenspezifischer Röntgenstrahlung können auch beschleunigte Ionen eingesetzt werden. Werden die Probenatome durch den Beschuss mit einem fokussierten Strahl aus energiereichen Protonen oder allgemein Ionen auf den inneren Schalen ionisiert, so kommt es u.a. zur Emission von elektromagnetischer Strahlung, z.B. von Röntgenstrahlung. Dieser Vorgang wird auch als partikel- bzw. protoneninduzierte Röntgenemission (kurz PIXE, von engl. Particel-/ Proton Induced X-ray Emission) bezeichnet.
Der apparative Aufbau eines solchen Messgerätes ist in der Regel um Dimensionen größer als herkömmliche Labortechnik (Länge von ca. 25 m). Ein solches Großgerät stellt hohe Anforderungen an den Betriebsort, da die Messtechnik schon vor kleinsten Erschütterungen (>500 nm!) gesichert werden muss. Abbildung 21 zeigt schematisch einen Laboraufbau eines PIXE-Systems. Herz dieses Großgeräts ist ein elektrostatischer Linearbeschleuniger, in welchem positiv geladene Ionen in einem elektrischen Gleichfeld beschleunigt werden[58]. Durch eine Hochfrequenz-Ionenquelle wird Wasserstoff in einem, durch einen Sender erzeugtes, elektromagnetisches Hochfrequenzfeld ionisiert. Die Protonen werden von einer Saugelektrode angezogen und in das Beschleunigungsrohr injiziert und mithilfe einer angelegten Hochspannung beschleunigt.
Über verschiedene Strahlführungs- systeme und Ablenkmagnete wird der Protonenstrahl fokussiert und über das Strahlführungssystem in die eigentliche Messkammer geführt. Die Messung selbst kann aufgrund der hohen Beschleunigungsspannungen von 2-3 bzw. 60 MeV (je nach Art der beschleunigten Ionen und
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten eingesetzter Beschleunigungstechnik) auch unter Atmosphärendruck
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 21: Schematische Darstellung der Anordnung der technischen Komponenten eines Ionenstrahllabors[58]
durchgeführt werden. Zur ortsaufgelösten Analyse im Submikrometerbereich wird zusätzliche eine sog. Ionennanosonde benötigt. Sie ermöglicht erst das hochaufgelöste Abtasten der Probe mit dem Ionenstrahl, so dass z.B. zweidimensionale Bilder einer Elementverteilung aufgenommen werden können. Diese Technik wird als Mapping (engl. Abbildung oder Kartierung) bezeichnet. Mehrere nachgeschaltete Quadrupollinsen und Aperturlinsen ermöglichen erst die Fokussierung des Protonenstrahls auf einige Mikrometer oder mehrere Zehn Nanometer bei Austritt aus dem Beschleuniger. Eine Rastereinheit am Ende des Teilchenbeschleunigers ermöglicht die magnetische Ablenkung des Ionenstrahls in zwei zueinander orthogonalen Richtungen mithilfe von Elektromagneten. Für ionenstrahlanalytische Untersuchungen werden verschiedene Detektoren verwendet, auf die nicht näher eingegangen werden kann. Der für diese Arbeit wichtigste Detektor ist der Röntgendetektor, der nach dem gleichen Prinzip arbeitet, wie jener bei der RFA oder ESMA. Die Detektoren gestatten bei geeigneter Anordnung eine Multielementanalyse über fast das gesamte Periodensystem.
Mikroskopische Proben werden meist auf einer biaxial orientierten Polyester-Folie (umgangssprachlich auch als Mylar®-Folie bekannt) oder PET-Folie (PolyethylenterephthalatFolie) fixiert. Die Folie ist wiederum an einem Metallrahmen aufgespannt. Die Abmessungen dieser Probenhalter betragen dabei meist nur einige Zentimeter. Die Folie hat den Vorteil, dass nur ein geringer Anteil des Protonenstrahls reflektiert wird. Zudem ist sie für Röntgenstrahlung durchlässig und besitzt nahezu keine Eigenröntgenfluoreszenz. Bei makroskopischen Proben werden auch Dünnschliffe dieser Proben angefertigt und direkt untersucht.
Bei dieser Analysentechnik finden eine Reihe weiterer physikalischer Vorgänge bei der Wechselwirkung von Protonen oder allg. geladenen Teilchen mit den Probenatomen statt. So entsteht neben der charakteristischen Röntgenfluoreszenzstrahlung auch charakteristische Gamma-Strahlung, die bei der sog. partikelinduzierten γ-Emission (engl. Particle Induced Gamma-ray Emission (PIGE)) detektiert werden kann. Simultane Messung der reflektierten Protonen gibt bei der Rutherford-Rückstreuspektrometrie (engl. Rutherford Backscattering Spectrometry (RBS)) Auskunft über Elemente an der Objektoberfläche. Transmittierte Protonen bzw. Teilchen können zur Transmissionsionenmikroskopie (engl. Scanning Transmission Ion Microscopy (STIM)) genutzt werden. Mit der STIM können Massenflächendichten abgebildet werden.
Die PIXE erlaubt aufgrund der starken Beschleunigungsspannung hohe Eindringtiefen und ein sehr gutes Signal/Untergrund-Verhältnis ohne das Auftreten eines Bremsspektrums, da die positiv geladenen Protonen im Coulomb-Feld der Probenatome nur geringfügig abgebremst werden. Die PIXE besitzt eine hohe Nachweisempfindlichkeit für Elemente ab der Ordnungszahl Z > 12 (Magnesium), wobei diese mit der Ordnungszahl steigt, da die Fluoreszenzausbeute ebenfalls mit der Ordnungszahl steigt (siehe Abschnitt Röntgenfluoreszenzanalyse (RFA)). Sie liegt aber i.d.R. bei 1 µg/g, bei leichter Matrix sogar bei ca. 0,05 µg/g. Damit ist die PIXE eine besonders nachweisstarke Analysenmethode (vgl. Tab. 3).
Zudem ermöglicht sie, ähnlich wie die RFA oder ESMA, eine standardfreie quantitative Elementanalyse. Diese ist jedoch von vielen Faktoren abhängig, so dass auch bei diesem System oftmals eine Rekalibrierung mithilfe eines internen Standards notwendig ist. Die PIXE gehört dem Grund nach zu den zerstörungsfreien Analysenmethoden. Jedoch kann auch hier bei sehr empfindlichen Proben, beispielsweise bei biologischen Proben, eine Strahlenschädigung auftreten.
Tab. 3: Vergleich der Nachweisgrenzen der drei vorgestellten und in dieser Arbeit verwendeten Analysetechniken
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
3.2.4 Laserablations-Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (LA-ICP-MS)
Die Massenspektrometrie ist ein physikalisches Verfahren, um im Vakuum stabile Ionen nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) zu trennen. Im hier vorliegenden Fall werden verschiedene Elementionen voneinander getrennt. Ebenso ist aber auch eine Trennung von ganzen Molekülen bzw. Molekülfragmenten nach ihrem Masse-Ladung-Verhältnis möglich, so wie es in der organischen Chemie genutzt wird.
In vielen Bereichen der qualitativen und quantitativen Analytik von Elementen und Molekülen wird die Massenspektrometrie vor allem aufgrund ihrer Schnelligkeit, Selektivität und ihrer Nachweisstärke geschätzt. Für die Elementanalytik eignet sich vor allem die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma, kurz ICP-MS.
Die ICP-MS kombiniert die leistungsstarke induktiv gekoppelte Plasmaanregung mit der nachweisstarken Massenspektrometrie. Dabei wird eine flüssige Probe über eine Pumpe in den Zerstäuber geführt und mithilfe eines Argongasstroms zu einem feinen Nebel versprüht. Da diese Tröpfchen noch zu groß für das effektive Arbeiten der Atomisierungs/Ionisierungsquelle sind, werden sie vorher auf eine Prallkugel geführt, wobei sie in nochmals kleinere Tröpfchen zerfallen und somit ein Aerosol gebildet wird. Der bekannte MeinhardZerstäuber funktioniert nach diesem Prinzip.
Das Aerosol wird anschließend mit dem Gasstrom in das Plasma des ICP-Brenners transportiert. Das Plasma besteht hier aus angeregten Argonatomen, Argonkationen und freien Elektronen die in einem Hochfrequenzfeld auf einer konzentrischen Bahn gehalten werden. Angeregt und ionisiert werden diese durch Stöße im Argonstrom. Durch die entgegenwirkende Widerstandskraft kommt es dabei zur ohmschen Erwärmung, so dass Temperaturen zwischen 8000 und 10000 K erreicht werden können. Im Plasma wird das Aerosol bei bis zu 10000 K zuerst vom Lösungsmittel befreit und anschließend atomisiert und ionisiert. Durch ein Interface wird der Atmosphärendruck bei dem die Plasmafackel arbeitet, schrittweise bis auf das im Massenspektrometer notwendige Vakuum erniedrigt. Das Interface besteht aus zwei Konen, dem Sampler-Cone und dem Skimmer-Cone. Beide bestehen aus gut wärmeleitendem Nickel. Anschließend gelangen die ionisierten Analyten in das Massenspektrometer, wo sie ein mehrteiliges Linsensystem passieren. Photonen und Neutralteilchen werden hier abgehalten in den Analysator zu gelangen. Die verschiedensten Analysator-Systeme sind heute auf dem Markt zugänglich. Die Auftrennung der Ionen mittels Sektorfeld oder Ionenfalle sind nur zwei von vielen Möglichkeiten. Für die vorliegende Arbeit wird ein Massenspektrometer mit einem Quadrupol-Massenseparator verwendet, wie er in Abbildung 22 schematisch gezeigt wird.
An je zwei gegenüberliegende, konzen- trische Stabelektrodenpaare gleicher Polung wird eine variable, entgegen- gesetzte hochfrequente Gleichspann- ung angelegt. Je nach angelegter Spannung gelangen nur Ionen mit bestimmtem Masse-Ladung-Verhältnis in stabilen, spiralförmigen Bahnen zum Massedetektor. Ionen mit einem
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb. 22: Schema eines Quadrupol-Massenseparators mit stabilen und instabilen Ionenbahnen[59]
kleineren oder größeren Masse-Ladungs-Verhältnis treffen auf die Stabelektroden, werden dort entladen und somit nicht detektiert. Durch Veränderung der Spannung an den Stabelektroden im Millisekunden-Bereich kann sequentiell ein Spektrum aufgenommen werden. Die passierten Ionen gelangen danach zum Detektor, wo sie registriert werden.
Die ICP-MS wird von spektralen als auch von nicht spektralen Interferenzen beeinflusst. Nicht spektrale Interferenzen sind vor allem abhängig von der Ausbeute der Aerosolerzeugung, dem Ionisationsgrad und dem Ionenstrom. Diese können aber durch Optimierung gezielter Gerätebauteile, wie der Ionenoptik, des Interfaces und durch Kollisionszellen, größtenteils vermindert werden.
Spektrale Interferenzen werden vor allem durch die Bildung doppelt geladener Ionen, durch polyatomare Störungen und isobare Überlappungen verursacht. Die Dikationenbildung und der Isobarenanteil lassen sich häufig rechnerisch korrigieren.
[...]
- Arbeit zitieren
- Dipl.-Chem. Gregor Christoph Schwartze (Autor:in), 2010, Mikrobereichsanalytik an marinen Biomineralisationsprodukten, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/168314
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