Zellpenetrierende Peptide (CPPs) stellen ein innovatives Konzept zur Transfektion von Oligonukleotiden in Säugerzellen dar. Die amphipatischen Peptide der sogenannten MPG-Familie bestehen aus einer hydrophoben und einer positiv geladenen Domäne und komplexieren Oligonukleotide spontan über nicht-kovalente Bindungen. Durch den Austausch der hydrophoben
Domäne gegen andere hydrophobe, virale Fusionssequenzen, wurden im Vorfeld dieser Arbeit weitere CPPs entwickelt, die ebenfalls Komplexe mit Oligonukleotiden ueber nicht-kovalente
Bindungen bilden. Um die biologische Anwendung der CPPs verbessern zu können, ist zunächst ein fundiertes biophysikalisches Verständnis der Komplexeigenschaften notwendig.
Deshalb lag der Fokus dieser Arbeit in der transientenkinetischen Analyse der Peptid/Oligonukleotid-Komplexbildung. Mittels Stopped-Flow Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Komplexbildung
in mindestens drei Schritten abläuft, dass elektrostatische sowie hydrophobe Wechselwirkungen daran beteiligt sind, und dass die Dissoziationskonstanten von Initialkomplexen
im nanomolaren Bereich liegen. Durch zeitabhängige DLS Messungen konnte die Hypothese bestätigt werden, dass die hydrophobe Peptiddomaene für die Ausbildung von hochmolekularen
Sekundär- und Tertiaerkomplexen verantwortlich ist. Weiterhin lieferten die im DLS ermittelten Komplexradien zusätzlich Hinweise auf die postulierte endosomale Komplexaufnahme.
Da die Komplexstabilität einen wichtigen Parameter der Transfektionseffzienz darstellt, wurde diese über Heparin induzierte Komplexdissoziationsexperimente sowie electrophoretic mobility shift assay (EMSA) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die hydrophobe Domäne essentiell für
die Ausbildung stabiler Komplexe ist und dass die Transfektionseffzienz mit der Komplexstabilität korreliert.
Inhaltsverzeichnis
- Zusammenfassung
- Einleitung
- Oligomere Nukleinsäure-Wirkstoffe
- Aptamere
- Steric block Oligonukleotide
- short interfering RNA
- Nukleinsäuretransport in die Zelle
- Zellpenetrierende Peptide
- Vorarbeiten
- Zielsetzung
- Oligomere Nukleinsäure-Wirkstoffe
- Material und Methoden
- Materialien
- Chemikalien
- Puffer
- Verbrauchsmaterialien
- Geräte
- Verwendete Peptid-Carrier
- Verwendete Oligonukleotid-Cargos
- Verwendete Fluorophore
- Methoden
- Peptid- und Nukleinsäure-Konzentrationsbestimmung
- Lagerung und Behandlung der CPPs
- Stopped-Flow Messungen
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Bestimmung der Komplexstöchiometrien
- Heparin induzierte Komplexdissoziation
- Dynamische Lichtstreuung (DLS)
- Radioaktive Markierung von Nukleinsäuren
- EMSA
- Autoradiographie
- Computer-unterstützte Hydrophobizitätsbestimmungen von Peptiden
- Materialien
- Ergebnisse
- MPGa
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- MPGẞ
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- fpEbola-NLS
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- fplVHA-NLS
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- fpRSV-NLS
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- fpFertilina-NLS
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- MPGa + 6K
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- fpBLV-NLS
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- fpSV-NLS
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- fpMVi-NLS und fpMVn-NLS
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- (Arginin)7
- Transientenkinetische Analyse der Komplexbildung
- Komplexgrößenanalyse mittels DLS
- Nachweis der Komplexbildung und -stabilität
- Linker-NLS
- Übersicht der kinetischen Parameter der Komplexbildung
- Zusammenfassung der DLS-Messungen
- Zusammenfassung der EMSA-Versuche
- Korrelation zwischen Komplexgröße und Geschwindigkeit der Komplexassoziation
- Heparin induzierte Komplexdissoziation
- Hydrophobizitätsbestimmung von CPPs
- MPGa
- Diskussion
- Mechanismus der Komplexbildung
- Geschwindigkeit der Komplexbildung in Abhängigkeit von der Peptidkonzentration
- Einfluss der hydrophoben Domäne auf die Komplexgröße und Komplexstabilität
- Einfluß der hydrophoben Domäne auf die Transfektionseffizienz
- Anhang
- Abkürzungsverzeichnis
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Diese Bachelorarbeit befasst sich mit der Charakterisierung der Komplexbildung zwischen zellpenetrierenden Peptiden (CPPs) und Oligonukleotiden. Ziel ist es, die Kinetik der Komplexbildung zu untersuchen und die Faktoren zu identifizieren, die die Geschwindigkeit, Größe und Stabilität des Komplexes beeinflussen. Darüber hinaus soll der Einfluss der hydrophoben Domäne des CPPs auf die Komplexbildung und die Transfektionseffizienz untersucht werden.
- Kinetik der Komplexbildung zwischen CPPs und Oligonukleotiden
- Einfluss der Peptidkonzentration auf die Geschwindigkeit der Komplexbildung
- Bedeutung der hydrophoben Domäne für die Komplexgröße und Stabilität
- Korrelation zwischen Komplexgröße und Transfektionseffizienz
- Untersuchung des Einflusses von Heparin auf die Komplexdissoziation
Zusammenfassung der Kapitel
Die Arbeit beginnt mit einer Einleitung, die den Hintergrund der Forschung und die Relevanz der Thematik erläutert. Anschließend werden die verwendeten Materialien und Methoden detailliert beschrieben. Im Kapitel „Ergebnisse“ werden die gewonnenen Daten präsentiert und analysiert. Diese umfassen u.a. die transientenkinetische Analyse der Komplexbildung, die Komplexgrößenanalyse mittels DLS und die Untersuchung der Komplexstabilität. Die Ergebnisse werden anschließend in der Diskussion eingeordnet und interpretiert. Abschließend werden die wichtigsten Erkenntnisse zusammengefasst und ein Ausblick auf zukünftige Forschungsmöglichkeiten gegeben.
Schlüsselwörter
Zellpenetrierende Peptide, Oligonukleotide, Komplexbildung, Kinetik, Hydrophobizität, Transfektion, Heparin, Stopped-Flow, DLS, EMSA, Transientenkinetische Analyse.
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- Hanno Sjuts (Autor), 2007, Charakterisierung der Komplexbildung zwischen Zellpenetrierenden Peptiden und Oligonukleotiden , Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/162062
