Aspekte der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktion im malignen Melanom

Doktorarbeit / Dissertation , 2005 , 141 Seiten , Note: magna cum laude

Biologie - Cytologie

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob MIA, neben Wechselwirkungen mit
Extrazellularmatrixmolekülen, auch spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche
von Melanomzellen interagieren kann. Zusätzlich sollte geklärt werden, um welche
Rezeptoren es sich dabei handelt. Zur Verbesserung der Detektion von MIA wurde
dieses biotinyliert. Die Herstellung des rekombinanten, biotinmarkierten Moleküls
erfolgte in einem zellfreien, in vitro Transkriptions-/Translationssystem auf E.coli
Basis (RTS Roche). Das daraus gewonnene, biotinmarkierte Protein wurde für die
gesamten Experimente verwendet. Die korrekte Faltung des Proteins konnte
dadurch verifiziert werden, dass es möglich war, das biotinylierte MIA mittels
Antikörper in einem bereits etablierten ELISA-Assay nachzuweisen. Durch
zusätzliche funktionelle Assays, wie Zellmigrationsassay und Invasionsassay,
konnte ebenfalls sichergestellt werden, dass die migrationshemmende Wirkung
von MIA auf Zellen in vitro, auch nach dessen Biotinmarkierung, erhalten blieb.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MIA die Aktivität der MAP-Kinase ERK 1/2
vermindert. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass MIA nicht nur an
Extrazellularmatrixproteine, sondern direkt spezifisch an die Fibronektinrezeptoren
alpha4 beta1 und alpha5 beta1 binden kann. Weitere Untersuchungen zur
Wirkungsweise von MIA auf Integrine ergaben, dass MIA die Aktivierung der
Integrine hemmen kann.
Im Rahmen eines weiteren Projekts stellte sich bei einer Untersuchung von Zell-
Zelldadhäsionsproteinen mittels Western Blot heraus, dass das klassische PCadherin
in Melanomzellen in einer verkürzten, 50 kDa Form vorliegt. Dabei
wurde gezeigt, dass die Verkürzung von P-Cadherin bereits auf mRNA-Ebene
nachgewiesen werden kann. Mittels RT-PCR konnte demonstriert werden, dass in
allen untersuchten Melanomzelllinien das 3´Ende der mRNA von P-Cadherin ab
Exon 10 fehlte.

Inhaltsangabe

Liste der verwendeten Abkürzungen Inhaltsangabe

1 Zusammenfassung

2 Einleitung
2.1 Struktur und Aufbau der Haut
2.1.1 Funktion der Melanozvten
2.2 Das Maligne Melanom
2.2.1 Das Melanom - Geschichtlicher Hintergrund
2.2.2 Mortalität und Inzidenz des malignen Melanoms
2.2.3 Proteine, die an der Entstehung des malignen Melanoms beteiligt sind
2.3 Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom
2.3.1 Cadherine
2.3.2 Die Rolle der klassischen Cadherine im malignen Melanom
2.4 Zell-Matrix-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom
2.4.1 Integrine
2.4.2 Die Struktur der Integrine
2.4.2.1 Die extrazelluläre Domäne
2.4.2.2 Die zvtoplasmatische Domäne
2.4.3 Die Rolle der Integrine im malignen Melanom
2.4.4 Die Integrinexpression in Melanozvten
2.4.5 Die Integrinexpression im malignen Melanom
2.5 Die Adhäsion von Zellen
2.5.1 Signalkaskaden, bei der Zell-Matrixadhäsion, ausgehend von Integrinen
2.5.2 Signalkaskaden bei der Zell-Zelladhäsion ausgehend von Cadherinen
2.6 Das Protein MIA
2.6.1 Die Rolle von MIA bei der Zelladhäsion im malignen Melanom Material und Methoden

3.1 Materialien
3.1.1 Allgemeine Materialien
3.1.2 Geräte
3.1.3 Organismen
3.1.4 Säugerzelllinien
3.1.5 Oligonukleotide
3.1.6 Peptide
3.2 Medien, Antibiotika und Puffer
3.2.1 Medien zur Anzucht von E.coli und Säugerzellkulturen
3.2.2 Antibiotika
3.2.3 Puffer und Lösungen
3.3 Methoden
3.3.1 Arbeiten mit Escherichia Coli
3.3.1.1 Kultivierung von Bakterien
3.3.1.2 Transformation von E.coli
3.3.1.3 Herstellung kompetenter Bakterien
3.3.1.4 Isolierung von Plasmid DNA
3.3.1.5 Isolierung von Plasmid DNA im größeren Maßstab (Midipräparation)
3.3.1.6 Isolierung genomischer DNA aus eukaryontischen Zellen.
3.3.2 Molekularbiologische Methoden
3.3.2.1 DNA- und RNA Methoden
3.3.2.1.1 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen
3.3.2.1.2 Gelelektrophorese von DNA
3.3.2.1.3 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten
3.3.2.1.4 DNA- und RNA-Konzentrationsbestimmung
3.3.2.1.5 Reverse Transkription
3.3.2.1.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
3.3.2.1.7 3'RACE (rapid amplification of cDNA ends)
3.3.2.2 RNA-Methoden: RNA Isolierung aus Säugerzellen bzw humanen Geweben_
3.3.2.3 Proteinchemische Methoden
3.3.2.3.1 Rekombinante zellfreie Herstellung von biotinyliertem MIA
3.3.2.3.2 Herstellung von Gesamtproteinextrakten
3.3.2.3.3 Konzentrationsbestimmung von Gesamt- und Kernproteinen
3.3.2.3.4 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
3.3.2.3.5 Western Blot
3.3.2.3.6 Proteindetektion auf Western-Blots
3.3.2.3.7 Silberfärbung im SDS Gel
3.3.2.3.8 ELISA
3.3.2.3.9 MAP-Kinase-Aktivitätsassay
3.3.2.3.10 Ko-Immunpräzipitation
3.3.2.3.11 Immunhistochemie
3.3.3 Zellkulturmethoden
3.3.3.1 Kultivierung von eukaryontischen Zellen
3.3.3.2 Stabile und transiente Transfektion von Zellkulturzellen
3.3.3.3 Durchflußzytometrische Analyse von Zellen (FACS)

4 Ergebnisse
4.1 Untersuchungen an einer verkürzten und sezernierten Form von P-Cadherin in Melanomzellen
4.1.1 Suche nach Veränderungen bei Zelladhäsionsmolekülen während der Entstehung des malignen Melanoms
4.1.2 Analyse der P-Cadherinexpression in Melanomzelllinien
4.1.3 Sezernierung der verkürzten Form von P-Cadherin
4.1.4 Analyse der in situ Expression der 50 kDa Form von P-Cadherin
4.1.4.1 Analyse der P-Cadherinexpression in tissue microarrays (TMA)
4.1.5 Western Blot Analyse von P-Cadherin in Melanommetastasen
4.1.6 Analyse der genomischen P-Cadherinsequenz in Melanomzelllinien
4.1.7 Analyse der P-Cadherin mRNA in Melanomzelllinien
4.2 Charakterisierung von spezifischen Bindungspartnern des Proteins MIA
4.2.1 Expression von rekombinantem biotinyliertem MIA
4.2.2 MIA reduziert die MAP-Kinase Aktivität im malignen Melanom
4.2.3 MIA bindet an die Zelloberfläche
4.2.4 Identifikation von MIA- Bindungspartnern
4.2.5 MIA bindet direkt an alpha4 beta1 und alpha5 beta1
4.2.6 MIA inhibiert Integrinaktivität
4.2.7 Analyse der Interaktion zwischen MIA und Integrinen

5 Diskussion
5.1 Identifikation einer trunkierten Form von P-Cadherin im malignen Melanom
5.2 Regulation des MAP-Kinase Signalweges über MIA
5.3 Bindung von MIA an Integrine alpha4 beta1 und alpha5 beta1

6 Literaturverzeichnis

7 Danksagung

Liste der verwendeten Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob MIA, neben Wechselwirkungen mit Extrazellularmatrixmolekülen, auch spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche von Melanomzellen interagieren kann. Zusätzlich sollte geklärt werden, um welche Rezeptoren es sich dabei handelt. Zur Verbesserung der Detektion von MIA wurde dieses biotinyliert. Die Herstellung des rekombinanten, biotinmarkierten Moleküls erfolgte in einem zellfreien, in vitro Transkriptions-/Translationssystem auf E.coli Basis (RTS Roche). Das daraus gewonnene, biotinmarkierte Protein wurde für die gesamten Experimente verwendet. Die korrekte Faltung des Proteins konnte dadurch verifiziert werden, dass es möglich war, das biotinylierte MIA mittels Antikörper in einem bereits etablierten ELISA-Assay nachzuweisen. Durch zusätzliche funktionelle Assays, wie Zellmigrationsassay und Invasionsassay, konnte ebenfalls sichergestellt werden, dass die migrationshemmende Wirkung von MIA auf Zellen in vitro, auch nach dessen Biotinmarkierung, erhalten blieb. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MIA die Aktivität der MAP-Kinase ERK 1/2 vermindert. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass MIA nicht nur an Extrazellularmatrixproteine, sondern direkt spezifisch an die Fibronektinrezeptoren alpha4 beta1 und alpha5 beta1 binden kann. Weitere Untersuchungen zur Wirkungsweise von MIA auf Integrine ergaben, dass MIA die Aktivierung der Integrine hemmen kann.

Im Rahmen eines weiteren Projekts stellte sich bei einer Untersuchung von Zell- Zelldadhäsionsproteinen mittels Western Blot heraus, dass das klassische P- Cadherin in Melanomzellen in einer verkürzten, 50 kDa Form vorliegt. Dabei wurde gezeigt, dass die Verkürzung von P-Cadherin bereits auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden kann. Mittels RT-PCR konnte demonstriert werden, dass in allen untersuchten Melanomzelllinien das 3'Ende der mRNA von P-Cadherin ab Exon 10 fehlte.

Mit einer 3'RACE PCR und einem Datenbankscreening, welches spezifisch für Spleißprodukte war, wurde ausgeschlossen, dass es sich bei der Verkürzung um alternatives Spleißen der mRNA handelte. Die Daten ließen auch den Rückschluss zu, dass es sich nicht um posttranslationale Prozessierung des Proteins handeln konnte. Publikationen über diverse fragile Stellen an der P-Cadherin Chromosomenstelle 16q22.1 führten zur Vermutung, dass die Verkürzung von P-Cadherin von einer Translokation an dieser Stelle im Chromosom herrühren muss. In weiteren Versuchen konnte zudem dargestellt werden, dass die verkürzte Form von P-Cadherin in Melanomzellen, im Gegensatz zur Wildtypisoform, nicht in der Membran der Zellen verankert ist, sondern in die extrazelluläre Matrix sezerniert wird. Mittels eines tissue microarrays konnte der membranständige und zytoplasmatische Verlust von P-Cadherin mit zunehmender Tumordicke und zunehmendem Clark Level bestätigt werden.

MIA wurde in vorliegender Arbeit eine aktive Rolle in der spezifischen Hemmung der Integrine alpha4 beta1 und alpha5 beta1 zugewiesen. Das in Melanomzellen trunkierte und sezernierte P-Cadherin kann durch homophile Interaktion mit membranständigem Vollänge-P-Cadherin benachbarter Zellen die Ausbildung normaler Zell-Zell-Kontakte möglicherweise verhindern. Dadurch ist es entarteten Zellen potentiell möglich, sich leichter aus dem organisierten Gefüge des Gewebes zu lösen.

Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation gezeigt werden, welchen Beitrag die Proteine MIA und P-Cadherin möglicherweise bei der Auswanderung von Tumorzellen aus dem Zellverband leisten können.

2 Einleitung

2.1 Struktur und Aufbau der Haut

Die Haut ist das größte Organ des Körpers. Sie ist eine unterschiedlich dicke, sehr sensible, gut vaskularisierte Schicht, die den Körper bedeckt. Die Basalmembran trennt die epitheliale Epidermis von der bindegewebigen Dermis. Die Dermis grenzt an das subkutane Fettgewebe, welches zwischen der Haut und tiefer liegenden Strukturen liegt. Die Epidermis ist die äußerste Schicht der Haut und enthält keine Nerven oder Blutgefäße. Sie schützt die Haut vor Umwelteinflüssen und regelt den Flüssigkeitshaushalt des Körpers. Sie besteht aus mehreren Zelllagen. Neben anderen spezialisierten Zellen enthält die Epidermis die Keratinozyten, die im Stratum basale als hochprismatische Basalzellen vorliegen. Ihre Tochterzellen wandern im Laufe der Zeit in Richtung Oberfläche und bilden dort zunächst das Stratum spinosum, welches eine weitere Lage aus polygonalen Zellen mit kurzen, stachelförmigen Fortsätzen bildet. Die älteren Zellen der nächsten Lage, dem Stratum granulosum, enthalten im Zytoplasma die namensgebenden Keratingranula. Keratin verleiht allen Teilen der Haut Festigkeit und Widerstandskraft. In der obersten Lage, dem Stratum corneum, befindet sich schließlich eine breite Lage von abgestorbenen Zellen, in denen das Keratin das gesamte Zytoplasma und den Nukleus ersetzt.

Weitere Zellen der Epidermis, welche nicht von den Basalzellen abstammen, sind die Melanozyten im Stratum basale. Diese Zellen bilden das Pigment Melanin und geben es an die Zellen der Epidermis und die Haarfollikel ab. Direkt unter der Epidermis liegt die Dermis. Diese Hautschicht besteht hauptsächlich aus dicken Bündeln von Kollagen, in dem Nerven, Blut- und Lymphgefäße, sowie Schweißdrüsen und Haarfollikeln, eingelagert sind. Bis in die Papillen im Stratum spinosum, versorgt sie auch die Epidermis mit Gefäßen (siehe Abbildung 2-1 und Abbildung 2-2 ).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-1

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-2

Vergrößerte Ansicht der Epidermis.

Die Abbildung zeigt, unter anderem, Melanozyten in der Basalzellschicht der Epidermis. Durch dendritische Ausläufer treten sie in Kontakt mit Keratinozyten (modifiziert nach Faller und Schünke, 2004).

2.1.1 Funktion der Melanozyten

Melanozyten entstammen in der Entwicklung aus den Zellen der Neuralleiste des Embryos. Die ersten Zellen, die der Melanozytenlinie zugeordnet werden können, sind die Melanoblasten; aus ihnen entstehen dann im Laufe der weiteren Entwicklung die ausdifferenzierten Melanozyten. Jeder Melanozyt besitzt Dendriten, die sich bis in die oberen Lagen der Epidermis erstrecken und Kontakte zu Keratinozyten knüpfen. Melanozyten produzieren Melanin, das dunkle Pigment von Haut, Haaren und Nägeln und transportieren es in Melanosomen in die nahegelegenen Haarzellen oder in die Keratinozyten. Zusammen mit 20 bis 35 Keratinozyten wird auf diese Weise eine epidermale Melanineinheit gebildet. Dieses Pigment schützt die DNA vor schädlichem UV-Licht (Hsu et al., 2002). Die Keratinozyten treten mit den Melanozyten in einem Verhältnis von 5:1 in Kontakt und kontrollieren das Wachstum und die Proliferation der Melanozyten (Hsu et al., 2002).

2.2 Das Maligne Melanom

Das maligne Melanom (MM) ist ein bösartiger, stark pigmentierter Tumor. Er wird definiert als eine geschwulstartige Entartung der pigmentbildenden Zellen, den Melanozyten, und manifestiert sich überwiegend in der Haut. Seltener tritt das MM an der Uvea und Retina, an Hirnhäuten, sowie den Schleimhäuten verschiedenster Stellen des Körpers auf. Das Maligne Melanom wird in vier klar abgegrenzte Subtypen eingeteilt (Panizzon et al., 1999):

Das superfiziell spreitende Melanom stellt mit einem Auftreten von mehr als 50 Prozent die häufigste Form des Melanoms dar und erscheint als asymmetrische Hautveränderung mit unregelmäßiger Pigmentierung und Begrenzung.

Das noduläres Melanom (30%) ist ein erhabenes Melanom, das ebenfalls mit Pigmentveränderungen und unregelmäßigen Ausläufern einhergeht.

Das lentigo-maligna Melanom (10%) tritt typischerweise bei älteren Personen an belichteten Hautarealen auf, z. B. auf der Wange.

Das akral-lentiginöse Melanom (5%) tritt an Händen und Füßen auf.

Daneben existieren noch weitere seltene Formen, wie das amelanotische, das desmoplastische und das polypoide Melanom.

2.2.1 Das Melanom - Geschichtlicher Hintergrund

Im Laufe der Jahrtausende veränderte sich das Verhältnis der Menschen zur Sonne stetig. Während in Griechenland vor 2000 Jahren das exzessive Sonnenbaden zur Heilung und Regeneration bei Krankheiten genutzt wurde, war im 17. und 18. Jahrhundert die blasse Porzellanhaut ein Merkmal der Anmut und

Schönheit; zudem ein Unterscheidungsmerkmal der reichen Klasse, von der Arbeiterklasse (Ariel et al., 1981). Im 20. Jahrhundert dagegen wurde die dunkel gebräunte Hautfarbe ein Zeichen für Leute, die mit Geld für ein exklusives und angenehmes Leben in warmen Klimazonen besaßen. Im Laufe der Jahrhunderte wurde der Zusammenhang zwischen erhöhter Sonnenexposition und dem Auftreten des malignen Melanoms sichtbar. Besonders in den letzten Jahrzehnten, in denen die schützende Ozonschicht immer dünner wurde und die Menschen sich immer mehr ohne Schutz dem Sonnenbaden hingaben, stieg die Zahl der Neuerkrankungen am malignen Melanom in Europa drastisch an (siehe unten).

Die erste Beschreibung des Melanoms als eigene Krankheit gab der Pariser Rene Laennec um 1806, der auch das Wort „melanosis" (griechisch für „Schwarz") einführte. 1834 beschrieb David Williams als erster die horizontalen und vertikalen Wachstumsphasen eines sich oberflächlich ausbreitenden Melanoms (Silvers, 1982) und 1837 wurde das Melanom zum ersten Mal in Amerika von Isaiah Parrish beschrieben. Zu Ende des 19. Jahrhunderts gaben Josef Coats (1885) und Herbert Snow (1892) schon erste Anleitungen zur chirurgischen Beseitigung von Läsionen. Erste Beweise, dass es UV-Strahlung ist, die Hauterytheme verursacht, wurden von Widmark 1889 erbracht (E. J. Widmark „Über den Einfluss des Lichtes auf die Haut). Der Zusammenhang zwischen Melanomen und der Sonneneinstrahlung wurde erst im Jahre 1894 von Unna (Randle et al., 1997) hergestellt; er beschrieb degenerative Hauterkrankungen bei Seeleuten („seamen's skin"), die er dem Einfluss der Sonne zuschrieb. 1907 folgte dann Dubreuilh, der Hautkrebserkrankungen an sonnenexponierten Stellen bei Traubenpflückern in Bordeaux darstellte (Dubreuilh, 1907). Die erste zusammenfassende Studie über Melanompatienten in England wurde von William Norris 1920 gemacht (Norris, 1820). 1957 zeigten dann Lancaster und Nelson in Australien, dass Personen, die nicht braun wurden, sondern stattdessen leicht Sonnenbrand bekamen und Sommersprossen besaßen, eher von Haukrebs betroffen waren, als Menschen mit braunem Teint. Sie machten die ersten wissenschaftlichen Versuche, das Sonnenlicht mit dem Auftreten von Melanomen zu korrelieren.

2.2.2 Mortalität und Inzidenz des malignen Melanoms

Bei Vergleich der Zahlen von 1990 bis 2000 steigt bei Männern und Frauen die Krebsinzidenz zwar an, die Mortalität jedoch blieb bei beiden Geschlechtern gleich. Im Jahr 1990 starben von 100000 Einwohnern 2,48 Männer und 1,6 Frauen, was sich bis ins Jahr 2000, mit 2,57 Männern und 1,7 Frauen, nicht sehr veränderte. Dies liegt an den stetig verbesserten Vorsorgeuntersuchungen und den modernen molekularen und bildgebenden Möglichkeiten, Melanome schon sehr früh zu diagnostizieren.

Die Zahl der Neuerkrankungen am malignen Melanom jedoch war 1990 bei Männern und Frauen, im Gegensatz zum Jahr 2000, relativ niedrig mit nur 2972 Männern und 4421 Frauen. Im Jahr 2000 stieg diese Zahl bei Männern auf 5348 und bei Frauen auf 6128. Die altersstandardisierte Krebsinzidenz fällt bei Männern und Frauen im Jahr 2000 auf ungefähr 12 je 100000 Einwohner, im Gegensatz zu 7,7, bei Männern, und 9,2, bei Frauen, im Jahr 1990 (Daten vom Robert Koch Institut).

http://www.rki.de/cln 006/nn 243922/DE/Content/GBE/DachdokKrebs/Datenbank abfragen/datenbankabfragen node.html nnn=true)

2.2.3 Proteine, die an der Entstehung des malignen Melanoms beteiligt sind

Eine natürliche Auswirkung der Sonnenstrahlung auf die Melanozyten ist die Anregung zur Produktion von Melanocortin (alpha-MSH), des Liganden des Melanocortin-1 Rezeptors (MC1R). Er schützt die Haut, indem er zur Produktion des Sonnenschutzpigments Eumelanin anregt. Verschiedene Varianten von MC1R bewirken hingegen die Produktion von Pheomelanin, welches weniger effektiv vor Sonneneinstrahlung schützt. Durch Sonneneinstrahlung werden aber auch Wachstumsfaktoren, wie der Stammzellfaktor (SCF), Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und der transformierende Wachstumsfaktor alpha (TGF alpha) gebildet. Deren Signale werden mittels des Ras/Raf Signalweges übertragen, was zur Transkription und Translation zahlreicher Gene führt, die die Zellproliferation und Migration der Zellen anregen.

Eine übermäßige Einwirkung von ultravioletter Strahlung auf die Haut kann jedoch bösartige Veränderungen in der Haut hervorrufen, indem sie direkt mutagen auf die DNA wirkt. Sie setzt die Immunabwehr herab und erzeugt oxidierte Formen von Melanin, die der DNA zusätzlichen Schaden zufügen und die Apoptose unterdrücken (Meyskens et al., 2004). Den so geschädigten Melanozyten ist es möglich, einen derartigen malignen Phänotyp anzunehmen, dass sie Blutgefäße zum Wachsen anregen können, dem Immunsystem entrinnen und schließlich metastasieren können (Satyamoorthy et al., 2002).

Im Folgenden werden einige der bekanntesten Proteine beschrieben, die für die Entstehung eines malignen Phänotyps der Melanozyten verantwortlich sind. Zu ihnen gehören Proteine, welche die Apoptose beeinflussen, Proteine der mitogenen Signalwege, Zellzyklusproteine und diverse Transkriptionsfaktoren.

Proteine, die an der Apoptose beteiligt sind

Dadurch, dass es den Melanomzellen durch die Überexpression von Apoptoseinhibitoren, wie BCL-2 und BclxL möglich ist, der Apoptose zu entkommen, ist eine Chemo- Radio- oder Immuntherapie zur Bekämpfung der Krankheit immer nur wenig erfolgreich (Soengas et al., 2003).

Proteine, die an mitogenen Signalwegen beteiligt sind

In 21% von Melanomzellinien ist N-RAS konstitutiv aktiv (Tsao et al., 1998). Ebenso sind in 70-90% von Primärmelanomen konstitutiv aktivierende BRAF- Mutationen enthalten (Davies et al., 2002; Dong et al., 2003; Shinozaki et al., 2004). Die Tatsache, dass man diese Mutationen auch in 60-80% gutartiger melanozytärer Nävi findet zeigt, dass hier eine hochkomplexe Maschinerie mit vielen „Sicherheitsstops" im Zellzyklus agiert, welche die Zellen trotz Mutation davor schützen, sich ungehindert zu vermehren.

Proteine, die am Zellzyklus beteiligt sind

Einen Zellzyklusstop bewirken die zwei Tumorsuppressoren p16 und p14ARF. Sie sind Produkte des Gens CDKN2A. Dieses Gen wird häufig in mutierter Form familiär vererbt und verleiht seinem Träger ein 8 fach höheres Risiko an Hautkrebs zu erkranken, als einem Träger des unmutierten Gens (Kefford et al., 2002). Intaktes p16 inhibiert Zyklin-abhängige Kinasen (CDKs), deren Funktion darin besteht die Proliferation von Zellen zu fördern. Durch einen Verlust von p16 läuft der Zellzyklus unkontrolliert weiter. P14ARF verstärkt die Wirkung des Tumorsuppressors p53. Dieses Protein ist hauptsächlich dafür verantwortlich, dass die DNA vor Schaden geschützt bleibt. P53 ist im malignen Melanom jedoch selten direkt mutiert. Durch eine Fehlregulation von p14ARF wird p53 aber vermehrt abgebaut. Dadurch kommt es zu einer erhöhten Rate der Zellteilung und damit zu einem erhöhtem Tumorrisiko (Sharpless et al., 2003).

Proteine, die am Signalweg von MITF beteiligt sind

Der Transkriptionsfaktor MITF ist maßgeblich an der Entwicklung des Pigmentsystems und der Melanogenese in Melanozyten beteiligt. Weil MITF an der Regulation vielfältiger tumorassoziierter Proteine beteiligt ist, scheint es auch bei der Entstehung des malignen Melanoms eine wesentliche Rolle zu spielen. Die maligne Veränderung der Proteine im Signalweg von MITF, hat folglich eine große Auswirkung auf die Entartung von Melanozyten. MITF ist für deren Entwicklung sehr wichtig, weil Melanoblasten, die kein MITF exprimieren, nach 2 Tagen sterben (Nakayama et al., 1995). Aktiviert wird MITF durch Pax3 (Galibert et al., 1999; Kamaraju et al., 2002) und Sox10 (Elworthy et al., 2003). Auch die LEF/TCF Familie von Transkriptionsfaktoren beeinflusst den MITF-Promotor (Dorsky et al., 2003; Saito et al., 2003). MITF bindet seinerseits an Promotoren der Gene Tyrp1, Dct und Silver. Diese Gene sind für die Bildung von Melanosomen wichtig (Du et al., 2003). Auch in die Apoptoseregulation greift MITF ein, indem es die Expression des apoptosehemmenden Proteins BCL2 erhöht. Das heißt, dass die Zellen eine vermehrte Überlebenschance haben, wenn vermehrt MITF in der Zelle vorliegt und dadurch das Tumorrisiko steigt.

Allgemeine Einflüsse auf die Entwicklung des malignen Melanoms

Während dem Übergang von einem normalen Melanozyten zu einer malignen Läsion und während der Transformation zu einem metastasierenden Tumor, vollziehen sich vielfältige Veränderungen in der Kommunikation zwischen den Zellen. Diese Veränderungen statten die Melanozyten mit der Fähigkeit aus, sich aus gewöhnlichen Zellverbänden zu lösen und sich schließlich der Kontrolle der Keratinozyten zu entziehen. Auf diese Weise ist es ihnen möglich, in umliegendes und entferntes Gewebe einzuwandern. Bei der Umwandlung in eine Tumorzelle beobachtet man bei den Melanozyten verschiedene Phasen, die einhergehen mit dem Verlust von E-Cadherin und der Expression von N-Cadherin. Dadurch werden die Zellen befähigt statt an Kerationzyten, an Fibroblasten und vaskuläre

Endothelzellen zu binden. Dazu kommt eine vermehrte Expression von Zell­Zelladhäsionsmolekülen, wie Mel-CAM, L1-CAM, oder den Integrinen alphav beta3 und alpha4 beta1.

Neben all diesen Einflüssen, welche Apoptose unterdrücken und Zellproliferation und Migration fördern, spielen bei der Entstehung des malignen Melanoms noch zahlreiche andere Proteine innerhalb und außerhalb der Zellen eine große Rolle. Dieses Faktum soll mit Abbildung 2-3 dargestellt werden. Alle Moleküle hier einzeln aufzulisten und zu beschreiben würde den Rahmen dieser Arbeit sprengen. Diese Dissertation stützt sich besonders auf die Untersuchung der Adhäsionsmoleküle, deren abnorme Expression und Beeinflussung von veränderten externen Faktoren letztlich für die Auswanderung der Krebszellen in anderes Gewebe, verantwortlich ist.

Bindung von Wachstumsfaktoren man anmerken, dass der Übergang von einem Schritt zum nächsten mit dramatischen Veränderungen innerhalb der Zellen einhergeht. So entwickelt sich nicht aus jedem Nävus ein dysplastischer Nävus. Andererseits ist es auch umstritten, ob Nävi generell einen Ausgangspunkt der Melanomentwicklung darstellen. Bisher besteht auch die Hypothese, dass Melanozyten direkt in die radiale Wachstumsphase übergehen können. Nävi enthalten normale Melanozyten, die weder strukturelle, noch zytogenetische Abweichungen aufweisen. Die dysplastischen Nävi zeigen schon strukturelle Abweichungen. In der radialen Wachstumsphase der primären Melanome breiten sich die Zellen ringförmig in der Epidermis aus, sind jedoch noch nicht metastasierend. Erst im späten Stadium der vertikalen Wachstumsphase können die primären Melanomzellen in die Dermis einwandern und haben das Potential zu metastasieren. In der letzten Phase, dem metastasierendem Melanom, wandern die Zellen vom Ursprungsort aus und besiedeln entfernt liegende Organe (Li et al., 2002).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-4

Phasen der Melanomentwicklung.

In der Abbildung finden sich nur einige wenige fehlregulierte Moleküle, die bei der Entstehung des Melanoms eine wichtige Rolle spielen.

2.3 Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom

2.3.1 Cadherine

Cadherine sind eine Gruppe funktionell miteinander verwandter transmembraner Glykoproteine, die Kalziumabhängige Zell-Zelladhäsion in allen soliden Geweben des Körpers vermitteln; dort sind sie für die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Gewebe zuständig (Gumbiner et al., 1996).

Zu ihrer Gruppe gehören

1) Klassische Cadherine, welche die Hauptkomponenten der Zell­Zellverbindungen darstellen (Typen I und II).
2) die desmosomalen Cadherine (Desmocolline und Desmogleine).
3) Protocadherine.
4) Cadherin-verwandte Proteine (zum Beispiel das fat protein in Drosophila)

(Siehe Suzuki 1996a).

Die Typen I der klassischen Cadherine stellen die E-, P- und N-Cadherin dar. Zum Typ II gehören alle Cadherine 5 bis 12. Die Cadherine werden differentiell über im Gewebe exprimiert. E-Cadherin kommt im Normalgewebe im Epithel vor, P- Cadherin in der Plazenta und embryonalem Gewebe und N-Cadherin wird hauptsächlich in Endothelien, Neuronal- und Muskelzellen exprimiert.

Cadherine bilden hochspezifische homophile Zell-Zelladhäsionen aus, d.h. sie helfen Zellen sich miteinander zu verbinden, indem die extrazellulären Komponenten von jeweils zwei gleichen Cadherinen miteinander in Wechselwirkung treten. Zusätzliche Stabilität wird dadurch erreicht, dass die intrazellulären Domänen der Cadherine mit dem Aktinzytoskelett verbunden sind (siehe Abbildung 2-5). Derartige Zell-Zell Verbindungen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Embryogenese (Takeichi et al., 1991) und der Aufrechterhaltung der Gewebestruktur und Homöostase im erwachsenen Organismus.

Die N- und C-Termini der Cadherinproteine befinden sich jeweils außerhalb beziehungsweise innerhalb der Zelle. Der extrazelluläre Teil besteht aus einer variierenden Anzahl sehr homologer Cadherindomänen, wobei jede Domäne aus ungefähr zehn Aminosäuren besteht.

Die klassischen Cadherine enthalten fünf Domänen EC1-EC5, beginnend am N- Terminus (siehe Abbildung 2-5). Für die direkte Bindung zwischen den Molekülen ist nur EC1 wichtig, wobei die verbleibenden vier Domänen als Platzhalter dienen, welche die Distanz zwischen den Zellen bewahren. Die N-terminale Domäne allein bewirkt keine funktionelle Bindung (Yap A et al., 1997). Zwischen diesen Domänen befinden sich hochkonservierte Kalziumbindestellen. Cadherine sind nur in Gegenwart von Kalzium stabil, welches an die für sie vorgesehenen Stellen binden muss, damit Zell-Zelladhäsion stattfindet.

Der zytoplasmatische Teil der klassischen Cadherine ist mit alpha-, Beta- und Gamma-Cateninen (Plakoglobinen) verbunden; das sind zytoplasmatische Proteine, die als Mediatoren zwischen den Cadherinen und den Aktinfilamenten dienen und so zur Zell-Zelladhäsion beitragen. Beta-Catenin bindet dabei direkt an die zytoplasmatische Domäne und dient als linker (Verbindungsbrücke) für eine alpha-Cateninbindung, welches an den N-Terminus von Beta-Catenin bindet (Funayama et al., 1995; Hulsken et al., 1994; Oyama et al., 1994). alpha-Catenin bindet in vitro und in vivo Kulturzelllinien direkt an das alphaactinin der Aktinfilamente (Rimm et al., 1995).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-5

Schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus von Cadherinen.

Das Protein ist mittels der Transmembrandomäne in der Zellmembran verankert. Die extrazelluläre Domäne (ED) verbindet durch homophile und kalziumabhängige Interaktion jeweils gleiche Zellen miteinander. Die ED besteht aus 5 homologen, sich wiederholenden Einheiten (EC1 bis EC5), wobei die homophile Interaktion mit EC1 zustande kommt. Die intrazelluläre Domäne ist mit dem Proteinkomplex der Catenine verbunden, die wiederum Kontakte zum Zytoskelett der Zelle herstellen und zusätzlich Signale an unterschiedliche Proteine der Zelle weitergeben. PM= Plasmamembran, HI= homophile Interaktion, ZS= Zytoskelett, Cd= Cadherin.

Gamma-Catenin (Plakoglobin) kann manchmal an Stelle von Beta-Catenin wirken. In Mausembryonen wurde jedoch festgestellt, dass es Beta-Catenin nicht vollständig ersetzen kann (Haegel et al., 1995). Plakoglobin ist der Hauptbestandteil von Desmosomen; dort ist es mit desmosomalen Cadherinen verbunden (Cowin et al., 1986). Deletiert man Plakoglobin, entstehen letale Herzfehler, wahrscheinlich durch Fehler in der Desmosomenstruktur, und es tritt ein früher Tod des Mausembryos ein. Es wurde bewiesen, dass eine stabile Ausbildung einer Adhäsion zwischen zwei Zellen nur zustande kommt, wenn die Cadherine zwei funktionell aktive Domänen besitzen: Die äußere Bindedomäne und die mit dem Zytoskelett verbundene zytoplasmatische Domäne (Ozawa et al., 1990; Nagafuchi et al., 1988; Brieher et al., 1996).

Die bekannteste Zell-Zell Verbindung ist die zonula adhaerens an der apiko- lateralen Grenze der Epithelien. Hier knüpfen Aktinfilamente an die adhäsiven Verbindungen an und lagern sich innerhalb der Zelle an der Zellmembran an. Sie bilden, gemeinsam mit dem adhäsiven Proteingerüst, ein sich kontrahierendes Netzwerk im Epithel, das, unter anderem, für die Morphologie der Epithelien verantwortlich ist (Mooseker et al., 1984; Madara et al., 1988).

Cadherine integrieren auch verschiedenste Signale und leiten diese in das Zellinnere. Diese Signale stammen von Wachstumsfaktoren (Bradley et al., 1993), Peptidhormonen (Brabant et al., 1995 ; Bracke et al., 1995), gap junctions (Paul et al., 1995) und Agonisten von Cholinrezeptoren (Williams et al., 1993). Durch sie werden den Zellen vielfältigste Wechselwirkungen mit ihrer Umwelt ermöglicht.

2.3.2 Die Rolle der klassischen Cadherine im malignen Melanom

Das Expressionsmuster der Cadherine ist beim Aufbau der Haut ein sehr wichtiges Kriterium. Das lokale Muster der Cadherine bestimmt die Verteilung der verschiedenen epidermalen Zelltypen im Raum und es gibt Hinweise darauf, dass E- und P-Cadherin eine wichtige Rolle bei der gerichteten Wanderung der melanozytären Vorläuferzellen im Embryo, spielen (Nishimura et al., 1999). E- Cadherin wird in der normalen Haut auf der Oberfläche von Keratinozyten, Melanocyten und Langerhanszellen gebildet und befindet sich an den interzellulären Grenzen zwischen Melanozyten und Keratinozyten (Tang et al., 1994; Silye et al., 1998). Eine Fehlfunktion der E-Cadherin-abhängigen Zell­Zellinteraktionen im Epithel schwächt zunächst die Zell-Zellverbindungen und verstärkt dadurch die Zellbeweglichkeit. Neben einem Verlust des epithelialen Phänotyps verlieren die Zellen auch die Fähigkeit, ihre Proliferation bei Zellkontakt einzustellen (Kontaktinhibition). Das Ergebnis ist eine unkontrollierte Proliferation und Invasion von Zellen (Takeichi et al., 1993).

Ein Hauptaugenmerk der Studien des letzten Jahrzehnts lag auf dem Einfluss von E-Cadherin bei der Entstehung einiger bösartiger Karzinome, wie Ösophagus-, Magen-, oder Brustkarzinome, sowie dem malignen Melanom. E-Cadherin wurde in Tumoren als Tumorsuppressor beschrieben. Das Protein war in malignem Gewebe entweder nicht vorhanden oder zeigte stets eine anomale Verteilung und niedrige Expression. Ein Verlust von E-Cadherin ging mit undifferenzierten epithelialen Karzinomen mit hohem Invasionspotential und Metastasierung einher (Shiozaki et al., 1991; Berx et al., 1995, 1996; Perl et al., 1998; Christofori et al., 1999; Melki et al., 2000; Poser et al., 2001; Hajra and Fieron 2002).

Neben Signalwegen, die spezifisch von Zell-Zellkontakten beeinflusst werden, konnten einige Studien in der letzten Zeit zeigen, dass E-Cadherin auch an diversen Signalwegen außerhalb der Adhäsion beteiligt ist. Einen bekannten Weg stellt dabei die beta-catenin/LEF/T-cell factor (TCF) Signalkaskade dar (Nollet et al., 1999; Novak and Dedhar 1999), oder der Faktor NFkappaB, dessen Expression bei Verlust von E-Cadherin im malignen Melanom, hochreguliert wird (Kuphal et al., 2004).

Ein Signal, welches regulatorisch auf E-Cadherin einwirkt, kommt von der Snail- Proteinfamilie, die E-Cadherinexpression reprimiert. Außerdem wurde gezeigt, dass Snail nur in Melanomen exprimiert wird, nicht jedoch in normalen Melanozyten. Ebenfalls konnte dargestellt werden, dass eine Erhöhung oder Erniedrigung der Snail-Expression in direktem Zusammenhang mit der Expression von E-Cadherin steht (Poser et al., 2001).

Für N-Cadherin wurde gezeigt, dass eine erhöhte Expression, bei gleichzeitigem Rückgang der E- und P-Cadherin Konzentration mit der Änderung des Phänotyps von epithelial zu mesenchymal einhergeht (Islam et al., 1996). Während der Entwicklung und Progression eines Melanoms, geht E-Cadherin verloren und dabei wird gleichzeitig die N-Cadherin-Expression erhöht. Dieses „Umschalten“ eines Cadherins auf ein anderes führt dazu, dass Melanozyten ihre Bindungspartner ändern und, statt an Keratinozyten, an Fibroblasten und VE- Zellen adhärieren (Hsu et al., 1996). Zusätzlich scheinen erhöhte N-Cadherin Proteinmengen die Apoptose von Zellen negativ zu beeinflussen (Li et al., 2001a).

Klinische Studien haben auch gezeigt, dass im VGP- Stadium des Melanoms E- und P-Cadherin- Expression niedrig und die N-Cadherin erhöht ist (Sanders et al., 1999). Ebenfalls wurde gezeigt, dass UVB Strahlung zur verminderten Expression von E-und P-Cadherinen in humanen epidermalen Melanozyten führen kann (Seline et al., 1996). Für P-Cadherin wurde gezeigt, dass bei verminderter Expression ein erhöhtes Invasionsrisiko von Lungenkarzinomen besteht (Smythe et al., 1999).

2.4 Zell-Matrix-Adhäsionsmoleküle im malignen Melanom

2.4.1 Integrine

Integrine sind die wichtigsten Proteine, mit deren Hilfe Zellen an die extrazelluläre Matrix binden können (siehe Abbildung 2-6). Sie sind an der Regulation vielfältigster physiologischer Prozesse, der embryonalen Entwicklung, der Angiogenese und der Tumorgenese beteiligt. Mit insgesamt 18 alpha­Untereinheiten und 8 Beta-Untereinheiten, bilden die Transmembranglykoproteine mindestens 25 verschiedene Integrinheterodimere. Sie verbinden das Aktinzytoskelett mit der extrazellulären Matrix und geben der Zelle auf diese Weise diverse Informationen über deren Lokalisation im Körper und ihr näheres zelluläres Umfeld (Pfarrer et al., 2003).

Abhängig von der Zusammensetzung ihrer Untereinheiten und Ligandenspezifität, lassen sich die Integrine in vier Unterfamilien einteilen:

Die beta1-Unterfamilie. Sie stellt die größte Unterfamilie dar, in der die beta1 Untereinheit mit 12 alpha Untereinheiten assoziiert sein kann. beta1 Integrine sind weit verbreitet und verbinden Zellen Hauptsächlich mit der extrazellulären Matrix Die Leukozytenspezifischen Beta2- und Beta7-Unterfamilien, welche die Interaktion mit interzellulären Adhäsionsmolekülen (ICAMs), E-Cadherin und Fibrinogen steuern

Die alphav-Unterfamilie, welche in der Säugerorganogenese eine wichtige Rolle spielt. Sie wird in Endothelien, Epithelien, Osteoklasten und verschiedensten Tumoren exprimiert (van der Flier and Sonnenberg 2001).

Die Beta3-Unterfamilie, ein Marker für erhöhte Cancerogenität in entarteten Melanozyten. Weiterhin ist das Heterodimer alphav Beta3 an der Entstehung des malignen Melanoms und anderen Tumoren, beteiligt. Auch das auf Blutplättchen exprimierte alphallb beta3 Integrin ist an der Invasion von Melanomzellen beteiligt und spielt eine wichtige Rolle bei der Koagulation (Trikha et al., 1997).

Neben der Rolle bei der Adhäsion an die extrazelluläre Matrix, sind Integrine auch an der Weiterleitung von Signalen in die Zelle („outside-in signaling“) und aus der Zelle heraus („inside-out signaling“) beteiligt (Aplin et al., 1998). Durch Signale innerhalb der Zelle wandeln sich Integrine von einer passiven, schwachen Bindungskonformation in eine aktive adhäsive Konformation und ändern so ihre Interaktion mit ihrem extrazellulären Umfeld. Bei dem Verlust der Adhäsion an die extrazelluläre Matrix werden Kaspasen aktiviert, welche die Apoptose einleiten. Dieser Vorgang wird auch „Anoikis“ bezeichnet (Stupak et al., 2001; Pankov et al., 2003).

2.4.2 Die Struktur der Integrine

Sowohl die alpha, als auch die Beta-Untereinheit der Integrine besitzen eine große extrazelluläre Domäne, einen kurzen transmembranen Bereich und eine zytoplasmatische Domäne von durchschnittlich 20 bis 50 Aminosäuren (siehe Abbildung 2-6). Eine Ausnahme dabei ist Integrin beta4, deren zytoplasmatischer Teil mehr als 1000 Aminosäuren umfasst. Einige alpha-Untereinheiten werden in der nähe ihrer Transmembrandomäne proteolytisch geschnitten (alpha3, alpha4, alpha5, alpha6, alpha7, alpha8 und alphav), wobei die zwei Ketten dann durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden sind.

Die Beta-Untereinheiten bestehen aus vier, jeweils circa 40 Aminosäuren langen, sich wiederholenden, zysteinreichen, Segmenten, nahe der Transmembrandomäne.

Die Ligandenbindung durch die alpha- und Beta-Untereinheiten, erfolgt am N- Terminus durch Dimerisierung (Mehta et al., 1998). Die zwei Untereinheiten sind nicht-kovalent miteinander verknüpft und haben, im Vergleich zu anderen Rezeptoren, schwache Bindungsaffinitäten zu ihren Liganden. Diese schwache Affinität sorgt dafür, dass sich Zellen schnell an ihre Umgebung haften, aber auch wieder lösen können, was die molekulare Grundlage für Zellmotilität und Invasion darstellt (Brakebusch et al., 2003).

2.4.2.1 Die extrazelluläre Domäne

Die extrazellulären Domänen der Integrin alpha-Untereinheiten bestehen aus sich siebenfach wiederholenden, 60 Aminosäuren langen Modulen, welche bivalente Kationen, wie Kalzium oder Mangan, binden können. Diese Module nehmen die Konformation einer scheibenförmigen Struktur an, dem siebenschneidigen Beta­Propeller (siehe Abbildung 2-6). Acht der alpha-Untereinheiten (alpha1, alpha2, alpha10, alpha11, alphaD, alphaE, alphaM und alphaX) enthalten eine I/A Domäne, welche wichtig für die Protein-Protein Interaktionen ist, und die Ligandenbindungsstelle bilden (Hynes et al., 2002). Die andere Hälfte der alpha­Untereinheiten, welche keine I/A Domäne besitzt bekommt die Ligandenspezifität durch ihre Beta-Untereinheiten, die mit ihnen interagieren. Diese Beta­Untereinheiten enthalten eine hochkonservierte I/A Domäne, welche durch ihr MIDAS-Motif in der Lage ist, Metallionen, wie Mn2+ oder Mg2+, zu binden. Durch Bindung der Metallionen, ändert sich die Konformation dieser I/A Domäne und macht so die Integrine bereit zur Bindung an ihre Liganden (= priming) (Humphries, 2004). Diese Domäne assoziiert mit einer Seite des Propellerkopfes der alpha-Untereinheit und bildet damit die Ligandenbindetasche der Integrine aus.

2.4.2.2 Die zytoplasmatische Domäne

Der zytoplasmatische Teil der alpha- und Beta-Untereinheiten stellt das Verbindungsglied zwischen extrazellulärer Matrix und dem Aktinzytoskelett der Zelle dar. Von dort aus leiten vielerlei rekrutierte Struktur- und Adapterproteine intrazelluläre Signale weiter.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-6

Aufbau eines Integrindimers.

Die Untereinheiten alpha und beta bestehen aus einer großen extrazellulären Domäne, einer transmembranen Domäne und einem meist kurzem zytoplasmatischen Bereich. Die alpha­Untereinheit besitzt am N-Terminus einen aus beta-Faltblättern geformten Bereich („Betapropeller“). Dieser ist in der Lage zweiwertige Kationen zu binden. Die beta-Untereinheit enthält zysteinreiche Segmente nahe der Transmembrandomäne und N-terminal eine I/A-Domäne, welche Metallionen binden kann. Die zytoplasmatischen Domänen geben Signale in das Zellinnere weiter (Abbildung nach Kuphal, Bauer und Bosserhoff, 2005).

2.4.3 Die Rolle der Integrine im malignen Melanom

Die Ergebnisse vorliegender Arbeit weisen darauf hin, dass das Protein MIA spezifische Integrine und deren Signalwege im malignen Melanom auf vielfältige Weise moduliert. Dadurch verändert sich das Adhäsionsverhalten der Zellen, und diese können in fremde Gewebe auswandern. Im Folgenden sollen die Integrine und ihre Signalwege vorgestellt werden von denen bekannt ist, dass sie ebenfalls eine Rolle bei der Entstehung des malignen Melanoms spielen. Normalerweise ist das Integrin-Expressionsmuster auf der Zelloberfläche sehr spezifisch in Raum und Zeit und hilft der Zelle sich perfekt auf ihre Umgebung einzustellen. Während der Embryogenese dienen Integrine auf den Zellen der Lokalisierung und Zielfindung ihres Bestimmungsortes. Viele Studien haben gezeigt, dass während der Entartung von Zellen das Expressionsmuster der Integrine verändert wird. Häufig geht erhöhte Integrinexpression mit einem metastasierendem Phänotyp der Zellen einher (Marshall et al., 1998).

2.4.4 Die Integrinexpression in Melanozyten

Normale Melanozyten haben ein Integrin-Expressionsmuster, das sich von Melanomzellen unterscheidet. In der Literatur findet man viele Studien, welche die unterschiedliche Expression der Integrinuntereinheiten verdeutlichen; man muss jedoch bei diesen Studien zwischen in situ-Analysen an Gewebeproben und Analysen von Zellen, die in Kultur gewachsen sind, unterscheiden. Es zeigen sich oft auch Unterschiede in der Betrachtung der Untereinheiten alleine, im Gegensatz zu Analysen mit Antikörpern, die gegen die Dimere gerichtet sind. Bei den Melanozyten scheinen in situ alpha3-, alpha6-, alphav-, und beta1-Untereinheiten vorhanden zu sein (Zambruno et al., 1993). Viele Untersuchungen zeigen aber auch, dass es starke Unterschiede zwischen Melanozyten in situ und in Kultur gibt. alpha5 beta1, alpha3 beta1 und alphav beta3, zum Beispiel, werden lediglich bei Melanozyten in Kultur gefunden, nicht jedoch in Melanozyten in situ. Ferner wurden bei Melanozyten in Kultur keine Expressionen von alpha1 beta1, oder alpha4 beta1 gefunden (Zamburno et al., 1993; Elshaw et al., 2001).

2.4.5 Die Integrinexpression im malignen Melanom

Eine herausragende Rolle für die Ausbildung von Metastasen des Brustkrebses und des malignen Melanoms spielt das Integrindimer alphav beta3. Eine Blockade dieses Integrins kann metastatisches Wachstum in vivo verhindern (Trikha et al., 2002). Im Melanomgewebe wurde außerdem gezeigt, dass die Expression der Integrine alpha3 beta1, alpha4 beta1, alpha5 beta1 erhöht ist (Friedl et al., 1998; Natali et al., 1993; Schadendorf et al., 1997; Johnson et al., 1999). Zusätzlich zeigten Studien von Hangan et al., dass alpha6 beta1 Integrine in vivo wichtig für die Metastasierung von Maus- Melanomzellen in die Leber sind (Hangan et al., 1997).

Studien, die sich auf Integrinmonomere konzentrierten, wiesen in primären und metastasierenden malignen Melanomen in situ erhöhte Expressionen der Untereinheiten alphav, alpha2, alpha3 und alpha4 nach (Moretti et al., 1993; Hartstein et al., 1997; Nikkola et al., 2004). In Gewebeschnitten von Patienten mit stark metastasierenden Zellen zeigte sich eine hohe Expression von alpha6, moderate Expression von alpha1 und keine alpha7 Expression (Ziober et al., 1999). Unter den fehlregulierten Integrin beta-Untereinheiten sind die Konzentrationen sowohl von beta1- als auch beta3 Integrinuntereinheiten in Melanommetastasen erhöht (Hartstein et al., 1997; van Belle et al., 1999; Nikkola et al., 2004).

2.5 Die Adhäsion von Zellen

Alle Zellen in den Geweben werden auf unterschiedliche Weise zusammengehalten. Eine sehr wichtige Rolle spielt dabei die extrazelluläre Matrix. Sie besteht hauptsächlich aus sezernierten Makromolekülen und stellt ein komplexes Gerüst dar, zu welchem die Zellen hauptsächlich über Integrine Kontakt aufnehmen. Die Matrix ermöglicht es den Zellen, sich in ihr zu bewegen und miteinander zu kommunizieren. Neben Kontakten zur Matrix, können Zellen auch untereinander adhärieren. Dies tun sie über vielfältige Zell-Zellverbindungen, die es ihnen ermöglichen zusammenhängende Gewebe auszubilden und Signale untereinander auszutauschen.

In Epithelien, wie der Epidermis der Haut, kaum extrazellulare Matrix vorhanden und besteht hauptsächlich aus der Basallamina, die wie eine dünne Matte unter der Basalzellschicht liegt. Hier halten die Zellen durch ihre Kontakte untereinander den meisten mechanischen Stress aus.

Dafür durchziehen Netzwerke von Aktinfilamenten das Zytoplasma, die dann an spezialisierte Verbindungen an der Plasmamembran, anhaften. Die Verbindungen, wiederum, knüpfen die Zellen entweder aneinander oder an die Basallamina.

2.5.1 Signalkaskaden, bei der Zell-Matrixadhäsion, ausgehend von Integrinen

Integrine kontrollieren viele Signalwege in der Zelle. Sie beeinflussen, zum Beispiel Tyrosinkinasen, Serin/Threoninkinasen, Phophoinositide und Signalkaskaden, die Zellen zum Wachstum, zur Proliferation oder zum programmierten Zelltod bringen. Um es den Zellen zu ermöglichen, spezifisch auf die überaus große Anzahl der Signale innerhalb und außerhalb zu reagieren, sind viele Helferproteine notwendig, um alle diese Vorgänge zu integrieren.

Diese Arbeit beschäftigt sich unter anderem mit der Frage, welche Signale bei der Ablösung der Integrine von ihrem Substrat, in die Zelle geleitet werden und welche Proteine dadurch beeinflusst werden. Im folgenden Abschnitt werden deshalb einige Proteine aufgeführt, von denen die Interaktion mit Integrinen bekannt ist und die an der Entstehung des malignen Melanoms beteiligt sind.

Fokal adhesion kinase (FAK)

FAK hat ein Molekulargewicht von 125 kDa und hat eine Schlüsselrolle in der Signalkaskade, die von den Integrinen ausgeht. Sie ist eine Nicht-Rezeptor Tyrosinkinase und ko-lokalisiert mit Integrinen an fokalen Adhäsionen. Dort regeln assoziierte Proteinkomplexe die Ansammlung und Integration des Aktinzytoskeletts. FAK kann sich selber phosphorylieren, reguliert die Zelladhäsion, Motilität, Proliferation, das Ausbreiten der Zellen und ist am Zelladhäsionsabhängigen Überleben beteiligt (Frisch et al., 1996; Xu et al., 2001; Schlaepfer et al., 1994; Calalb et al., 1995; Schaller, 2001). FAK interagiert mit Proteinen, wie c-SRC, SHC, CSK PI-3-Kinase, Paxillin, dem SH3-Adapterprotein p130Cas und GRB2 und ist so mit dem MAP-Kinase Signalweg verbunden (Cobb et al., 1994; Guinebault et al., 1995; Sabe et al., 1994; Schlaepfer et al., 1997; Khwaja et al., 1997; Chen et al., 1995). Die Verbindung zu vielfältigsten Proteinen, die eine zentrale Rolle in der Tumorprogression und Metastasierung spielen, macht FAK zu einem wichtigen Faktor in der Entstehung eines malignen Phänotyps. Deshalb ist dieses Protein auch ein Ziel für die Antitumortherapie.

In Melanomzellen scheint FAK für die Substratadhäsion verantwortlich zu sein. Es wurde außerdem gezeigt, das FAK im malignen Melanom konstitutiv aktiv ist. (Kahana et al., 2002). Es gibt auch eine Verbindung von FAK zur Kinase EphA2, die den Prozess der vaskulären Mimikry in hoch aggressiven Melanomzellen vermittelt (Hendrix et al., 2003). Abbildung 2-7 zeigt die Zusammenhänge und die unterschiedlichen Reaktionen der Zelle auf die FAK-Signalkaskaden.

Integrin-linked kinase (ILK)

Bis jetzt gibt es relativ wenige Informationen darüber, welche Rolle die ILK bei der Entwicklung des Melanoms spielt. Überexpression oder der Entzug des Proteins haben weit reichende Konsequenzen auf die Zellen. Dies lässt den Rückschluss zu, dass ILK an der Entartung und Transformation vieler Zellen beteiligt ist. ILK wurde 1995 als ubiquitär exprimierte zytosolische Serin/Threoninkinase entdeckt. Es bindet an die zytoplasmatischen Teile von beta1 und beta3 Integrinen und besteht selber aus drei Domänen (Hannigan et al., 1996; Pasquet et al., 2002). Man findet das Protein an fokalen Adhäsionen, an Verbindungen zwischen Integrinen und dem Aktinzytoskelett und es ist sehr wichtig für die Ausbildung von Zellkontakten mit der extrazellulären Matrix (Wu 2001; Wu and Dedhar 2001). ILK interagiert mit vielen Proteinen, welche Signalverbindung zwischen der extrazellulären Matrix, Wachstumsfaktoren und dem Aktinzytoskelett herstellen (Yamaji et al., 2001; Tu et al., 2001; Nikolopoulos et al., 2001; Persad and Dedhar 2003) (siehe Abbildung 2-7). Einige Proteine lassen sich in vitro direkt von ILK phosphorylieren (Troussard et al., 1999). ILK ist in der Lage Apoptose zu unterdrücken und das Überleben der Zellen zu fördern (Delcommenne et al., 1998; Persad et al., 2000). Die Überexpression von ILK in Epithelzellen resultiert in einem Verlust von Zell-Zell- und Zell-Matrix Kontakten und fördert auf diese Weise Zelladhäsion unabhängiges Wachstum (Radeva et al., 1997). Im Melanom wurde außerdem gezeigt, dass eine vermehrte Expression von ILK mit der Progression des Tumors korreliert und einen inversen Zusammenhang mit der 5 Jahre Überlebensrate von Patienten zeigt (Dai et al., 2003).

Abbildung 2-7 zeigt die unterschiedlichen Reaktionen der Zellen, für die der ILK Signalweg verantwortlich ist.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-7

Schematische Darstellung der Signalwege von den Integrinen über FAK (fokal adhesion kinase) und ILK (integrin linked kinase)

Beide Kinasen werden von Integrinen und Wachstumsfaktoren stimuliert. Sie zeigen weit reichenden Einfluss auf das Überleben, die Fortbewegung und die Proliferation von Zellen.

SRC homology and collagen (SHC)

Auch für SHC ist die Bedeutung im Melanom noch nicht ganz geklärt. Jedoch sprechen auch hier viele Indizien dafür, dass seine Dysregulierung auch sehr wichtig in der Entstehung von entarteten Melanozyten ist. Das Adapterprotein SHC spielt aber ebenfalls in der Signalkaskade von Integrinen eine wichtige Rolle. Es wurde gezeigt, dass beta1 Integrine und alphav beta3 an SHC, mittels des Adapterproteins Caveolin, assoziieren (Wary et al., 1998). Wenn SHC phosphoryliert wird, ist es in der Lage MAP-Kinasen zu aktivieren und das Zytoskelett der Zellen zu organisieren (Luzi et al., 2000). Viele Studien haben auch demonstriert, dass SHC in Signalwege eingreift, die an der Entwicklung von malignen Zellen beteiligt sind. C-Myc Aktivierung (Gotoh et al., 1997), Signalwege der Apoptose (Sakai et al., 2000; Friedmann et al., 1996), Zytoskelettorganisation und mitogene Signale über Ras. Widersprüchliche Veröffentlichungen zeigen SHC zum einen als Substrat von FAK, zum anderen aber gibt es Berichte über unabhängige Rollen von FAK und SHC in fokalen Adhäsionen und der Motilität von Zellen (Wary et al., 1996; Barberis et al., 2000).

Extracellular signal-related kinase (ERK)

Im ERK Signalweg laufen viele Stimuli von wichtigen Integrin-Signalträgern, wie FAK oder SHC, zusammen (siehe Abbildung 2-8). Auf diese Weise wird über diesen Weg fast jede wichtige zelluläre Aktivität gesteuert (Howe et al., 2002). Der FAK Signalweg wird von den meisten Integrinen genutzt. Der Signalweg über SHC wird nur von einem kleinen Teil der Integrine, nämlich apha1 beta1, alpha5 beta1 und alphav beta1, genutzt. Wie groß der Einfluss jedes dieser Signalwege auf ERK ist, hängt entscheidend vom jeweiligen Zelltyp ab und wie stark oder schwach die Zelle an das Substrat anhaftet. SHC scheint ERK sehr stark nach dem ersten Zell-Matrixkontakt zu aktivieren; die eher langsame Aktivierung von ERK durch FAK scheint eher zu anhaltender ERK Aktivierung zu führen.(Wary et al., 1996).

Während Melanozyten eine sehr geringe ERK-Aktivität besitzen, ist in Melanomzelllinien ERK konstitutiv aktiv (Satyamoorthy et al., 2003). Damit geht auch die verminderte Fähigkeit der Melanomzellen einher, sich zu differenzieren (Englaro et al., 1998; Kim et al., 2002). Verantwortlich für die konstitutive ERK Aktivierung sind multiple Komponenten. Während die Ras-Isoformen im malignen Melanom eher selten verändert vorliegen (van Elsas et al., 1995; Herlyn and Satyamoorthy 1996) ist B-Raf in mehr als 66 % mutiert (Davies et al., 2002). Viele autokrine Wachstumsfaktoren (bFGF, HGF, IGF, alpha-MSH, EGD, SCF, NGF) werden während der malignen Transformation von Melanozyten sezerniert. Dies trägt zusätzlich zum hohen Aktivitätslevel von ERK in Melanomen bei (Mattei et al., 1994; Lazar-Molnar et al., 2000; Satyamoorthy et al., 2001). Mit der Hochregulation der ERK-Expression geht schließlich auch eine verminderte Fähigkeit der Zellen einher, sich zu differenzieren.

Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)

Auch für den EGFR Rezeptor wurde gezeigt, dass er durch Integrine aktiviert wird. Durch Signale der extrazellulären Matrix vermitteln diese Rezeptortyrosinkinasen Zelladhäsion abhängiges Wachstum und Proliferation. EGFR Aktivierung führt letztendlich zur Aktivierung des ERK-1/MAP-Kinase Signalweges und führt so die Zellen in die S-Phase des Zellzyklusses (siehe Abbildung 2-8). Die vier, miteinander verwandten EGFR Rezeptoren EGFR/ErbB1, EGFR/ErbB2, HER- 3/ErbB3 und HER-4/ErbB4 bilden miteinander Homo- und Heterodimere und reagieren sehr spezifisch auf extrazelluläre Signale (Arteaga, 2002; Prenzel et al.,2000) . Durch Signale von außen dimerisiert und autophosphoryliert EGFR. Es bindet daraufhin an viele Proteine, welche die MAPK - und andere Signalwege stimulieren. Viele Studien konnten zeigen, dass EGFR abhängige MAPK Aktivierung wichtige Proteine der Apoptose beeinflusst, was das kontrollierte Absterben von Zellen, auch nach Ablösung von ihrem Substrat, erschwert. (Jost et al., 2001; Marani et al 2004).

Die Überexpression und Mutationen des EGF-Rezeptors führen häufig zu Brustkrebs, Eierstockkrebs, Lungenkrebs oder Prostatakarzinomen (Prenzel et al.,2000) . In Melanomzellen, sowie im Urin von Melanompatienten, findet man häufig erhöhte Konzentrationen des EGFR Liganden TGF-alpha (Gordon-Thomson et al.,2001) . Fehlerhafte Expressionen von EGFR werden auch in Melanomen im Endstadium gefunden. (Kraehn et al., 1995; Kari et al., 2003). Weiterhin wurden in immunhistochemischen Studien die Überexpression der Onkogene c-erbB2 und c- erbB3 in kutanen und metastasierenden malignen Melanomen entdeckt (Bodey et al., 1997). In Melanozyten ist EGFR nur in geringen Mengen vorhanden und TGF- alpha bewirkt hier keine Induktion von Wachstum der Zellen in vitro (Gordon- Thomson et al., 2001).

Caveolin

Caveolin ist ein (siehe Abbildung 2-8). 22 kDa schwerer Transmembranadapter, der eine ganze Reihe von Oberflächenrezeptoren mit intrazellulären Signalwegen verbindet. Die Integrin-Caveolin Interaktion wird vom Urokinaserezeptor uPAR reguliert und stabilisiert (Wei et al., 1999;). Es wurde gezeigt, dass Caveolin ständig mit beta1 Integrinen assoziiert ist (Wary et al., 1998; Wary et al., 1996). Eine Unterdrückung der Expression von Caveolin in Nierenzellen beeinflusst die Bindung von Liganden an Integrine zwar nicht, jedoch gehen keine Signale mehr von den beta1 Integrinen aus und das wiederum hat zur Folge, dass fokale Adhäsionskontakte verloren gehen.

In Melanomen ist nur sehr wenig bekannt über Caveolin. Wenn man jedoch die Einflüsse dieses Proteins auf die unterschiedlichen tumorassoziierten Proteine, wie Src Kinasen, den Ras-ERK Signalweg und uPar bedenkt, könnte man sich auch hier eine potentielle Rolle in der Melanomentwicklung vorstellen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2-8

Schematische Darstellung des Signalweges von den Integrinen und EGFR zur ERK-Signalkaskade und die daraus resultierenden Reaktionen der Zelle.

2.5.2 Signalkaskaden bei der Zell-Zelladhäsion ausgehend von Cadherinen

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen eine Verkürzung des klassischen P- Cadherins in Melanomzellen. Im folgenden Abschnitt wird deshalb kurz dargestellt, was über Cadherine bisher bekannt ist. Cadherine bilden Komplexe mit Cateninen, welche die Cadherine funktionell an das Aktinzytoskelett binden (Kemler 1993). Änderungen in der Zusammenstellung von Cadherin-Catenin Komplexen beeinflussen die Signalwege, die von den Cadherinen in die Zelle geleitet werden. Es wird vermutet, dass Wnt-Signale den Cadherin-Catenin Komplex an der Membran stabilisieren und so die Cadherin abhängige Adhäsion in manchen Zelllinien verstärkt (Bradley et al., 1993; Hinck et al., 1994). Einige Signalwege innerhalb der Zelle sind auch für die Auflösung des Komplexes verantwortlich, zum Beispiel die Expression von aktiviertem Cdc42 oder Tyrosinphosphataseinhibitoren (Ozawa and Kemler, 1998a). Die physiologische Rolle dieser Auflösung ist jedoch noch nicht geklärt. Die kleinen GTPasen Rac,Rho und Cdc42 sind indirekt an der Cadherin vermittelten Zelladhäsion beteiligt, weil sie auf das Aktinzytoskelett einwirken; aber auch bei der Überexpression von konstitutiv aktivem Rac beobachtete man eine Akkumulation von E-Cadherin, Beta-Catenin und Aktin an Zell-Zellkontakten in Epithelien, während dominant­negatives Rac den Gegensätzlichen Effekt auf die Adhäsion hat (Kaibuchi et al., 1999; Takaishi et al., 1997).alpha-Catenin interagiert, neben Aktin, mit einer Anzahl von Aktin bindenden Proteinen, wie alpha-Actinin, Vinculin und ZO-1 (Knudsen et al., 1995; Rimm et al., 1995; Watabe-Uchida et al,. 1998; Imamura et al., 1999).

Vinculin ist dabei wichtig, E-Cadherin in die zonula adherens in Epithelien zu rekrutieren, spielt jedoch keine Rolle bei der Adhäsion selbst (Watabe-Uchida et al., 1998). Die ZO1-Bindestelle an alpha-Catenin ist wichtig für die stärke der Cadherin vermittelten Adhäsion in Zellen, die nicht-epithelialen Ursprungs sind, scheint aber nicht wichtig für die Funktion von E-Cadherin in adherens junctions in Epithelzellen zu sein (Imamura et al., 1999).

Auch die Tyrosinphosphorylierung des Cadherin-Catenin Komplexes ist bei der Regulation der Adhäsion von Bedeutung (Daniel and Reynolds 1997). Bei Phosphorylierung von Beta-Catenin wurde eine Inhibierung der Caterin vermittelten Adhäsion beobachtet (Shibamoto et al., 1994).

Das Protein p120ctn bindet an einen zytoplasmatischen Teil der Cadherine an dem nicht die Catenine binden (Thoreson et al., 2000). P120ctn scheint die Zelladhäsion in manchen Zellen zu unterbinden und in manche zu stärken, weil zu einen beobachtet wurde, dass die Expression von mutiertem p120ctn zu einer Verfestigung der Zelladhäsion führt (Ohkubo and Ozawa 1999) zum anderen wurde gezeigt, dass die Entkopplung von p120ctn von E-Cadherin durch Mutation an der zytoplasmatischen Domäne, eine Verstärkung der Adhäsion hervorruft (Thoreson et al., 2000).

2.6 Das Protein MIA

MIA ist auch unter dem Namen CD-RAP (cartilage-derived retinoic acid sensitive protein) bekannt, und wird normalerweise in Chondrozyten exprimiert (Dietz und Dandell 1996). Pathologisch jedoch wird es im Melanom gebildet (Blesch et al., 1994). Ursprünglich wurde das Protein aus der Melanomzellinie HTZ19 isoliert.

Bei dieser Zelllinie handelt es sich um eine Hirnmetastase mit sehr langsamer Progression (Bogdahn et al., 1987). MIA zeigte nach der Reinigung aus dieser Zelllinie eine starke Proliferationshemmung (Bogdahn et al., 1989). Diese Eigenschaft gab ihm den Namen „melanoma inhibitory activity“ (MIA). Weiterhin wurde bewiesen, dass MIA die DNA Synthese inhibiert und ein Abrunden der Zellen verursacht (Blesch et al., 1994).

Das MIA-Gen im Menschen liegt auf Chromosom 19 (q13.32-q13.33 (Kohler et al., 1996) und in der Maus auf Chromosom 7 (19q13.2) (Dietz et al., 1996; Bosserhoff et al., 1996). Der melanomspezifische MIA-Promotor und zellspezifische Transkriptionsfaktoren regulieren die MIA-Expression. Der MIA Promotor enthält das hochkonservierte Promotorelement HCR (highly conserved region). Dar Transkriptionsfaktor HMG1 und p65, einem Protein der NfkappaB Familie, sind wichtige Faktoren in der Regulation der MIA-Expression. Dabei interagiert der Tanskriptionsfaktor HMG1 mit p65, und bindet an den MIA-Promotor. (Poser et al., 2003). Es wurde außerdem gezeigt, dass die Melanomspezifische MIA-Expression auch durch ein negatives cis-regulatorisches Element in der 5' HCR Region kontrolliert wird. Der T-Zell Faktor bindet (TCF) bindet dabei als Negativregulator zusammen mit dem Ko-Repressor CtBP1 an das Promotorelement von MIA und unterdrückt dadurch dessen spezifische Expression in Melanozyten (Poser et al.,2002) .

MIA wird als Präprotein synthetisiert und enthält 131 Aminosäuren. Es wird aus der Zelle über eine Signalsequenz von 24 Aminosäuren hinaustransportiert. Das native, prozessierte Protein hat 107 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 11 kDa. MIA wird in hohen Konzentrationen in allen Melanomzelllinien gebildet und in eher geringen Konzentrationen in gutartigen melanozytären Nävi. In normalen Melanozyten, Keratinozyten und Fibroblasten wird MIA nicht gefunden (van Groningen et al., 1995; Bosserhoff et al., 1996). Durch rekombinantes MIA kann die Invasion von Melanomzellen in vitro zu 40-60% gehemmt werden (Bosserhoff et al., 1996). Wie im nachfolgenden Kapitel beschrieben wird, resultiert diese Hemmung aus der Blockierung der Zelladhäsion.

Die dreidimensionale Struktur von MIA besitzt eine starke strukturelle Homologie zu SH3-Domänen. Insgesamt ist MIA aus 7 antiparallelen Beta-Strängen aufgebaut. Diese bilden dann zwei antiparallele Beta-Faltblattstrukturen, eingebettet von zwei Loop-Strukturen, welche auch in SH3-Domänen vorkommen.

[...]

• Hochschule: Universität Regensburg (Universitäts-Klinikum Regensburg)
• Note: magna cum laude
• Autor: Richard Bauer (Autor:in)
• Erscheinungsjahr: 2005
• Seiten: 141
• Katalognummer: V93069
• ISBN (eBook): 9783638055314
• Sprache: Deutsch
• Schlagworte: Aspekte, Zell-Zell-, Zell-Matrix-Interaktion, Melanom