Der Schwerpunkt dieser Dissertation ist die molekulare Analyse der Isoprenoid (IPP)-Biosynthesewege und der Glucose-6-phosphat Isomerase in den verschiedenen Vertretern der Plantae (Streptophyta/Chlorophyta, Rhodophyta und Glaucophyta), der Alveolata (Dinophyta, Apicomplexa, Perkinsea und Ciliata) und der "Chromista" (Haptophyta, Stramenopile und Cryptophyta).
Erst seit etwa zehn Jahren ist bekannt, dass Pflanzen über einen cytosolischen, aber auch über eine unabhängigen, plastidären Weg der IPP-Biosynthese verfügen. Die Genomanalyse von Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyta) legt das Fehlen des cytosolischen MVA-Pathways in Grünalgen nahe. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Verteilung in der Grünalge Mesostigma viride, einem Schlüsselorganismus der Evolution von Charophyceen und Landpflanzen (Streptophyta), umfassend charakterisiert. Die transformierbare Diatomee Phaeodactylum tricornutum dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Zellbiologie komplexer Algen. Durch Transformation mit eGFP-Reportergen-Konstrukten soll untersucht werden, ob die subzelluläre Lokalisation beider Wege zur Isoprenoid-Biosynthese nach der sekundären Endosymbiose erhalten blieb.
Die Verteilung der beiden Stoffwechselwege ist in den verschiedenen Abteilungen der "Chromista" und der Alveolata bisher unbekannt und wird im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Besondere Bedeutung haben die entsprechenden IPP-Gene im Zusammenhang mit dem in jüngster Zeit kontrovers diskutierten Ursprung komplexer Algen durch sekundäre und tertiäre Endosymbiosen. Insbesondere die phylogenetischen Beziehungen der Haptophyten zu den Stramenopilen und Cryptophyten sollen in diesem Kontext untersucht werden, um die angebliche Monophylie der "Chromista" kritisch zu hinterfragen. Hinsichtlich der Alveolata können durch die Verteilung der beiden IPP-Biosynthesewege mindestens zwei offene Fragen der Evolution untersucht werden. Einerseits ist trotz der kompletten Sequenzierung des Malaria-Erregers immer noch offen, ob sich der heterotrophe Plastid der Apicomplexa auf eine Rotalge zurückführen lässt.
Andererseits ist der plastidäre MEP-Pathway ein ideales Testsystem zur genaueren Untersuchung jüngster Hinweise auf die Präsenz eines bisher unbekannten Plastiden in den Perkinsea, die eine evolutive Schlüsselstellung innerhalb des Superensembles Alveolata haben.
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Die Endosymbionten-Theorie
- Die Evolution eukaryotischer Algen Primäre und sekundäre Endosymbiose
- Der Ursprung komplexer Algen mit rotem Plastiden - "Chromista" und Alveolata
- Die Haptophyten
- Die Diatomeen
- Proteintransport über Plastidenmembranen
- Proteinimport in die komplexen Plastiden der Diatomee Phaeodactylum tricornutum
- Die Glucose-6-phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution
- Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP)
- Der Mevalonat (MVA)-Weg der IPP-Biosynthese
- Der Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg der IPP-Biosynthese
- Verbreitung von MVA- und MEP-Pathway
- Zielsetzung dieser Arbeit
- Material und Methoden
- Geräte
- Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Enzyme
- Kommerzielle Reagenzsätze (Kits)
- Arbeiten mit E. coli
- Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren
- In dieser Arbeit verwendetes Algen-Zellmaterial
- Herkunft des Algenmaterials
- Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Algenspezies
- Arbeiten mit Nukleinsäuren
- Standard-Methoden beim Arbeiten mit DNA
- Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tricornutum
- Arbeiten mit RNA
- Grundlagen des Arbeitens mit RNA
- Isolation von Gesamt-RNA aus verschiedenen Algenspezies
- Konzentrationsmessung von RNA-Präparationen
- Aufreinigung von poly(A)*-RNA aus verschiedenen Algenspezies
- RT-PCR Experimente zur partiellen Amplifikation von Transkripten für die GPI, den cytosolischen und den plastidären Weg der IPP-Biosynthese
- Erstellung von Aminosäure-Alignments zur Konzeption degenerierter Primer
- Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation unbekannter Transkripte der GPI und der Gene der IPP-Biosynthesewege
- Konzeption sequenzspezifischer Primer zur Amplifikation von Transkripten der GPI und der IPP-Biosynthese
- Durchführung von RT-PCR Experimenten
- Screening von genomischen und cDNA-Banken zur Isolierung von Genen für die GPI, die DXR und die HMGR
- Sequenzierung von DNA
- Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen der IPP-Biosynthesewege in Phaeodactylum tricornutum
- Der Phaeodactylum Transformations-Vektor pPha-T1
- Herstellung von eGFP-Reportergen-Konstrukten zur Untersuchung der Lokalisation der DXS, DXR und HMGR in Phaeodactylum
- Stabile genetische Transformation von Phaeodactylum mittels Helium-Partikel-Kanone
- Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung und fotografische Dokumentation transformierter Phaeodactylum-Zellen mittels eines konfokalen Laserscanning Mikroskops
- Nachweis der Reportergen-Konstrukte in transformierten Phaeodactylum-Zellen
- Phylogenetische Analysen
- Ergebnisse
- In silico Etablierung von Referenz-Sequenzen und Erstellung von Aminosäure-Alignments
- Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation von unbekannten Genfragmenten
- Die Verbreitung der Glucose-6-phosphat Isomerase in den Plantae, den Alveolata und den "Chromista"
- Evolution des eukaryotischen Primärstoffwechsels
- Analyse von Genen der Glucose-6-phosphat Isomerase
- Untersuchung des cytosolischen und plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese
- Phylogenetische Analysen von Algenarten
- Proteintransport über Plastidenmembranen
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Diese Dissertation untersucht die Evolution der Glucose-6-phosphat Isomerase (GPI) und des cytosolischen sowie plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese in eukaryotischen Algen. Dabei werden molekulare, zellbiologische und phylogenetische Analysen von Genen des eukaryotischen Primärstoffwechsels durchgeführt.
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung gibt einen Überblick über die Endosymbionten-Theorie und die Evolution eukaryotischer Algen, insbesondere die Haptophyten und Diatomeen. Des Weiteren werden die Proteintransportmechanismen über Plastidenmembranen und die Glucose-6-phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution diskutiert. Abschließend wird die Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP) und die Verbreitung des Mevalonat (MVA)- und Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weges beschrieben.
Das Kapitel "Material und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien, Geräte und Methoden, wie z.B. Arbeiten mit E. coli, Plasmiden und Bakteriophagen-Vektoren, Isolierung von Nukleinsäuren, RT-PCR Experimente, Screening von genomischen und cDNA-Banken, Sequenzierung von DNA, Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen und phylogenetische Analysen.
Das Kapitel "Ergebnisse" präsentiert die in silico Etablierung von Referenz-Sequenzen und die Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation von unbekannten Genfragmenten. Des Weiteren werden die Ergebnisse zur Verbreitung der Glucose-6-phosphat Isomerase in den Plantae, den Alveolata und den "Chromista" dargestellt.
Schlüsselwörter
Die Dissertation befasst sich mit der Evolution des eukaryotischen Primärstoffwechsels, insbesondere der Glucose-6-phosphat Isomerase, der Isoprenoid-Biosynthese und dem Proteintransport über Plastidenmembranen. Wichtige Themen sind die Endosymbionten-Theorie, phylogenetische Analysen, Haptophyten, Diatomeen, Plantae, Alveolata, "Chromista", Mevalonat (MVA)-Weg, Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg und RT-PCR Experimente.
- Quote paper
- Dr. Carina Grauvogel (Author), 2007, Die Evolution der Glucose-6-phosphat Isomerase und des cystolischen sowie plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/91098
