Brustkrebs stellt eine der häufigsten Todesursachen der Frau dar. Die Wahrscheinlichkeit einer Frau in ihrem Leben an Brustkrebs zu erkranken beträgt 10%. Bei vorliegender Keimbahnmutation ist die Wahrscheinlichkeit einer Mammakarzinomerkrankung deutlich erhöht (85% Erkrankungs-wahrscheinlichkeit bis zum 75. Lebensjahr bei einer Keimbahnmutation in den Genen BRCA1 und BRCA2). 5 bis 20% der Brustkrebserkrankungen sind auf Keimbahnmutationen zurückzuführen. Der Anteil der Gene BRCA1 und BRCA2 an erblichen Brustkrebserkrankungen beträgt 40 bis 50%.
Eine heterozygote Keimbahnmutation ist für die Entstehung eines Mammakarzinoms nicht ausreichend. Die Funktion des Gens und seines Genproduktes kann vollständig durch das zweite, nicht mutierte Allel übernommen werden. Folglich sind weitere Veränderungen notwendig, die eine Inaktivierung des zweiten Allels und damit den vollständigen Funktionsverlust des Gens und des Genproduktes bewirken. Ein solches Ereignis wird als second hit bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen von Loss of heterozygosity (LOH) und Hypermethylierung als second hit bei neun Patientinnen mit Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 untersucht. Die dazu notwendigen Methoden wurden am Institut für Humangenetik der Universität Leipzig etabliert.
In der vorliegenden Arbeit gelang die Etablierung und Diskussion von DNA-Isolierungstechniken aus mit Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Proben. Ferner wurden Primer und Bedingungen für methylierungsspezifische PCRs getestet, die bei der Untersuchung einer größeren Stichprobe angewendet werden können.
Bei sechs der neun Patientinnen gelang die DNA-Isolierung und Amplifikation in einer nachfolgenden PCR. Ein LOH konnte mittels direkter Sequenzierung bei 50% der Trägerinnen einer Keimbahnmutation in den Genen BRCA1 und BRCA2 nachgewiesen werden (BRCA1: 2/4; BRCA2: 1/2). Hypermethylierung wurde mit Hilfe methylierungsspezifischer Primer nach Bisulfit-vermittelter Deaminierung der Proben untersucht. Als Positivkontrolle wurde eine mit CpG-Methylase behandelte Normalkontrolle genutzt. Der Nachweis von Hypermethylierung gelang nicht (BRCA1: unzureichende Analysebedingungen; BRCA2: 0/6). Dem LOH ist eine große Bedeutung bei der vollständigen Inaktivierung der Gene BRCA1 und BRCA2 nach vorhergehender Keimbahnmutation auf einem Allel zuzurechnen.
Inhaltsverzeichnis
1. Einführung in die Problematik
1.1. Erblicher und sporadischer Brustkrebs
1.2. Ablauf der Karzinogenese
1.3. An der Auslösung von Brustkrebs beteiligte Gene
1.3.1. BRCA1 – breast cancer susceptibility gene 1
1.3.2. BRCA2 – breast cancer susceptibility gene 2
1.3.3. Weitere Brustkrebs-beeinflussende Gene und BRCAX
1.4. Charakteristika erblichen Brustkrebses
1.5. Diagnose und Prävention bei familiärem Brustkrebs
1.6. Zielstellung
2. Material und Methoden
2.1. Auswahl der Patientinnen
2.2. Angewandte Methoden
2.2.1. Entparaffinieren und Separation der Tumorzellen
2.2.2. Isolierung genomischer DNA
2.2.2.1. Phenolreinigung
2.2.2.2. Invisorb Kit
2.2.2.3. Qiagen Kit
2.2.2.4. Chelex Spurenisolierung
2.2.3. Reinigung genomischer DNA
2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung
2.2.5. Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.2.6. Gelelektrophorese
2.2.7. Sequenzierung
2.2.7.1. Probenvorbereitung
2.2.7.1.1. Reinigung der PCR–Produkte
2.2.7.1.2. Sequenzierreaktion
2.2.7.1.3. Fällung
2.2.7.2. Sequenzieren
2.2.7.2.1. Reinigung der Platten
2.2.7.2.2. Zusammensetzen der Gelkammer und Gießen des Gels
2.2.7.2.3. Sequenzervorbereitung und Probenauftrag
2.2.8. Untersuchung des Methylierungsstatus
2.2.8.1. Deaminierung
2.2.8.2. Reinigung
2.2.8.3. Methylierungsspezifische PCR
2.3. Übersicht über verwendete Reagenzien
2.4. Übersicht über genutzte Geräte
3. Ergebnisse
3.1. Tumormaterial der Patientinnen
3.2. DNA-Isolierung, PCR und Gelelektrophorese
3.3. Reinigung genomischer DNA und photometrische Konzentrationsbestimmung
3.4. Mutationsprofil des Tumorgewebes
3.5. Loss of heterozygosity als second hit
3.6. Hypermethylierung als second hit
4. Diskussion
4.1. Methodendiskussion
4.1.1. Tumormaterial der Patientinnen
4.1.2. Isolierung genomischer DNA
4.1.3. Reinigung genomischer DNA
4.1.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung
4.1.5. PCR
4.1.6. Gelelektrophorese
4.1.7. DNA-Sequenzierung
4.1.8. Hypermethylierung
4.2. Ergebnisdiskussion
4.2.1. Mutationsprofil im Tumorgewebe
4.2.2. Loss of heterozygosity beim Mammakarzinom
4.2.3. Hypermethylierung
4.2.4. Weitere Ereignisse, die zum vollständigen Verlust der Expression führen könn(t)en
4.2.5. Ansatzpunkte für weitergehende Untersuchungen
Zielsetzung & Themen
Diese Arbeit zielt darauf ab, die Rolle von genetischen und epigenetischen Veränderungen, spezifisch Loss of Heterozygosity (LOH) und Hypermethylierung, als „second hit“-Ereignisse bei der Karzinogenese des hereditären Mammakarzinoms zu untersuchen, um bei Patientinnen mit bekannten Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 den vollständigen Funktionsverlust dieser Tumorsuppressorgene nachzuweisen.
- Analyse des Mutationsprofils in Tumorgewebe bei erblicher BRCA-Mutation
- Etablierung und Evaluation von Methoden zur DNA-Isolierung aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe
- Untersuchung von LOH als Mechanismus für den Funktionsverlust des zweiten Allels
- Bestimmung der Rolle der Hypermethylierung in der Promotorregion von BRCA1 und BRCA2
- Methodische Diskussion zur Effizienz verschiedener genetischer Analysetechniken
Auszug aus dem Buch
1.2. Ablauf der Karzinogenese
Molekularbiologisch sind die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen an der Krebsentstehung beteiligt. Onkogene sind Gene, deren Genprodukte Zellen transformieren können, so dass diese wie Krebszellen wachsen. Sie greifen in Signaltransduktionswege, Transportprozesse oder die Wachstumsregulation ein. Produkte von Onkogenen sind Wachstumsfaktoren, Kinasen, membrangebundene G-Proteine, Transkriptions-faktoren und Regulatoren des Zellzyklus. Proto-Onkogene codieren für wachstumsfördernde Faktoren. Bei einer mutationsbedingten Änderung eines Proteins, einer Überexpression, einer Expression in „falschen“ Zelltypen und/oder dem Nichtabschalten der Expression können sie in ein Onkogen übergehen. Tumorsuppressorgene codieren Genprodukte, die eine Kontrolle auf den Zellzyklus und das Zellwachstum ausüben. Sie wirken bei der Zelladhäsion, der Signaltransduktion, der Kontrolle der Transkription, der DNA-Reparatur, kontrollieren den Zellzyklus oder induzieren Apoptose. Der Wegfall dieser Kontrolle führt zu einer vermehrten und unregulierten Zellteilung und damit zur Tumorbildung. BRCA1 und BRCA2 sind Beispiele für Tumorsuppressorgene. Sie wirken bei der Kontrolle der Transkription, des Zellzyklus und der DNA-Reparatur.
Nach der „second hit-Hypothese“ von Knudson erfolgt die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen in zwei Schritten. Zunächst wird eines der beiden Allele inaktiviert. Ursache ist eine Keimbahn- oder eine sporadische Mutation. Im zweiten Schritt folgt der Funktionsverlust der zweiten Genkopie. Das kann durch einen kompletten oder teilweisen Verlust des Gens durch einen sog. Loss of heterozygosity (LOH), durch eine verminderte Promotorfunktion durch Hypermethylierung oder durch eine weitere somatische Mutation geschehen.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einführung in die Problematik: Dieses Kapitel gibt einen Überblick über die Epidemiologie des Mammakarzinoms und erläutert die genetischen Grundlagen der Karzinogenese, insbesondere das Zwei-Schritte-Modell der Tumorsuppressorgeninaktivierung bei erblicher Prädisposition durch BRCA1 und BRCA2.
2. Material und Methoden: Hier werden die Auswahl der Patientinnen aus Hochrisikofamilien und die etablierten molekularbiologischen Verfahren beschrieben, darunter verschiedene DNA-Isolierungsmethoden, PCR-Bedingungen, Gelelektrophorese, Sequenzierung und Verfahren zur Untersuchung des Methylierungsstatus.
3. Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die Daten zur DNA-Isolierung aus Tumorgewebe, das Mutationsprofil der Proben sowie die Ergebnisse der Untersuchungen zu LOH und Hypermethylierung bei den untersuchten Patientinnen.
4. Diskussion: Die Ergebnisse werden kritisch bewertet, wobei insbesondere die methodischen Herausforderungen bei der Arbeit mit archivalem Gewebematerial sowie die Bedeutung der gefundenen LOH-Ereignisse für die Inaktivierung der Tumorsuppressorgene im Vergleich zur Hypermethylierung eingehend analysiert werden.
Schlüsselwörter
Mammakarzinom, hereditärer Brustkrebs, BRCA1, BRCA2, Tumorsuppressorgene, Karzinogenese, second hit-Hypothese, Loss of Heterozygosity, LOH, Hypermethylierung, DNA-Isolierung, Mutation, Sequenzierung, Keimbahnmutation, genetische Prädisposition.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit?
Die Arbeit untersucht die molekulargenetischen Mechanismen bei hereditärem Brustkrebs, insbesondere wie sich bei Patientinnen mit einer Keimbahnmutation in den Genen BRCA1 oder BRCA2 das zweite Allel im Tumorgewebe inaktiviert.
Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?
Die Schwerpunkte liegen auf der Karzinogenese des Mammakarzinoms, dem Verständnis der Funktionen der Tumorsuppressorgene BRCA1 und BRCA2 sowie der Etablierung von Nachweisverfahren für genetische Alterationen in Tumorgewebe.
Was ist das primäre Ziel der Studie?
Das Hauptziel bestand darin, LOH und Hypermethylierung als mögliche „second hit“-Ereignisse zu untersuchen, die nach der ursprünglichen Keimbahnmutation zum vollständigen Ausfall der Tumorsuppressorgene in den Krebszellen führen.
Welche wissenschaftlichen Methoden wurden verwendet?
Es wurden molekularbiologische Techniken wie DNA-Isolierung aus fixiertem Gewebe, Polymerasekettenreaktion (PCR), Gelelektrophorese, direkte DNA-Sequenzierung und methylierungsspezifische PCR eingesetzt.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine detaillierte Darstellung der Materialien und angewandten Methoden, gefolgt von der Präsentation der Ergebnisse hinsichtlich des Mutationsprofils und der Inaktivierungsmechanismen, sowie einer kritischen Diskussion der methodischen Ansätze.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Die wesentlichen Begriffe sind BRCA1/BRCA2, hereditäres Mammakarzinom, Loss of Heterozygosity (LOH), Hypermethylierung, Second-Hit-Modell und molekulargenetische Tumoranalyse.
Wie erfolgreich war die DNA-Isolierung aus den Tumorgewebeproben?
Die Isolierung erwies sich als äußerst schwierig, da es sich um formalinfixiertes und in Paraffin eingebettetes Material handelte; letztlich war nur die Chelex-Spurenisolierung bei hoher Proteinase-K-Konzentration und langer Inkubation erfolgreich.
Welche Schlussfolgerungen zieht der Autor bezüglich der Hypermethylierung?
Der Autor konnte bei den untersuchten Proben keine Hypermethylierung als Inaktivierungsmechanismus nachweisen und schlussfolgert, dass dies bei den untersuchten Patientinnen keine relevante Rolle als "second hit" für BRCA2 spielt.
Wie häufig wurde ein Loss of Heterozygosity (LOH) bei den Patientinnen gefunden?
Bei drei der sechs untersuchten Patientinnen, bei denen eine Mutationsanalyse erfolgreich durchgeführt werden konnte, wurde ein LOH im Bereich der krankheitsrelevanten Keimbahnmutation nachgewiesen.
- Arbeit zitieren
- Heinz-Jürgen Voß (Autor:in), Ursula G. Froster (Autor:in), 2004, Beziehungen zwischen somatischen Mutationen im Tumorgewebe und bekannter Keimbahnmutation der Gene BRCA1 und BRCA2 beim hereditären Mammakarzinom, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/78643
