Im Jahre 2002 starben in den Entwicklungsländern ca. 1,5 Millionen Kinder an Diarrhoe-Erkrankungen. Einer der Erreger der kindlichen Diarrhoe ist das enterohämorrhagische Escherichia coli Bakterium, welches mittels eines Typ-III-Sekretionssystems Pathogenitätsfaktoren in die Darmzellen des Wirtes injiziert. Darunter befinden sich Proteine, die an Wirts-Adapterproteine andocken und eine pedestal-Bildung hervorrufen. Nck2 ist ein solches Adapterprotein und dessen SH2-Domäne ist für die spezifische Erkennung entscheidend.
In dieser Diplomarbeit wird beschrieben, wie die SH2-Domäne des humanen Nck2-Adapterproteins expressiert, gereinigt und kristallisiert wird um sie zu charakterisieren und die Proteinstruktur wird aufgeklärt.
Inhaltsverzeichnis
- Expression
- Reinigung
- Kristallisation
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Diese Diplomarbeit untersucht die Expression, Reinigung und Kristallisation der SH2-Domäne des humanen Adapterproteins Nck2. Das Hauptziel ist die Gewinnung von hochreinen, kristallisierten Proteinen, um deren dreidimensionale Struktur mittels Röntgenkristallographie aufzuklären.
- Expression der SH2-Domäne von Nck2
- Reinigung des exprimierten Proteins
- Kristallisation des gereinigten Proteins
- Optimierung der Expressions- und Reinigungsprotokolle
- Charakterisierung der erhaltenen Kristalle
Zusammenfassung der Kapitel
Expression: Dieses Kapitel beschreibt detailliert den Prozess der Expression der SH2-Domäne des humanen Adapterproteins Nck2 in einem geeigneten Expressionssystem. Es werden die gewählte Expressionsstrategie, der verwendete Vektor und die Kultivierungsbedingungen ausführlich erläutert. Die Optimierung des Expressionsprozesses zur Maximierung der Proteinausbeute wird ebenfalls behandelt, inklusive der Analyse der Expressionslevel mittels verschiedener Methoden wie SDS-PAGE und Western Blotting. Der Fokus liegt auf der Erzeugung einer ausreichenden Menge an Protein für die nachfolgenden Reinigungsschritte.
Reinigung: Dieses Kapitel befasst sich mit der Reinigung des exprimierten Proteins. Es werden verschiedene chromatographische Methoden beschrieben, die zur Isolierung der SH2-Domäne von anderen zellulären Proteinen eingesetzt wurden. Die einzelnen Reinigungsschritte, einschließlich der Wahl der geeigneten Säulenmaterialien und Pufferbedingungen, werden im Detail dargestellt. Die Wirksamkeit der Reinigung wird anhand von SDS-PAGE und anderen analytischen Methoden belegt. Das Ziel dieses Kapitels ist die Darstellung eines hochreinen Proteinpräparats, das für die Kristallisation geeignet ist. Die Reinheit und Ausbeute des gereinigten Proteins werden kritisch bewertet.
Kristallisation: In diesem Kapitel wird der Prozess der Kristallisation der gereinigten SH2-Domäne von Nck2 beschrieben. Es werden verschiedene Kristallisationsmethoden und -bedingungen, wie z.B. die Verwendung verschiedener Fällungsmittel und Temperaturvariationen, diskutiert. Der Fokus liegt auf der Optimierung der Kristallisationsbedingungen, um die Bildung von qualitativ hochwertigen Kristallen zu gewährleisten, die für die Röntgenstrukturanalyse geeignet sind. Die erhaltenen Kristalle werden bezüglich ihrer Qualität und Größe charakterisiert, um die Eignung für die Röntgenkristallographie zu beurteilen.
Schlüsselwörter
SH2-Domäne, Nck2, Adapterprotein, humane Zelle, Proteinreinigung, Proteinkristallisation, Expressionsoptimierung, Chromatographie, Röntgenkristallographie.
Häufig gestellte Fragen (FAQ) zur Diplomarbeit: Expression, Reinigung und Kristallisation der SH2-Domäne von Nck2
Was ist das Thema dieser Diplomarbeit?
Die Diplomarbeit befasst sich mit der Expression, Reinigung und Kristallisation der SH2-Domäne des humanen Adapterproteins Nck2. Das Hauptziel ist die Gewinnung hochreiner, kristallisierter Proteine zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur mittels Röntgenkristallographie.
Welche Methoden werden in der Arbeit verwendet?
Die Arbeit beschreibt detailliert die Expression der SH2-Domäne in einem geeigneten System, inklusive der Optimierung des Prozesses. Die Reinigung erfolgt mittels verschiedener chromatographischer Methoden. Die Kristallisation wird durch Variation von Methoden und Bedingungen optimiert. Analytische Methoden wie SDS-PAGE und Western Blotting werden zur Charakterisierung des Proteins und der Kristalle eingesetzt.
Welche Kapitel umfasst die Arbeit?
Die Arbeit gliedert sich in die Kapitel Expression, Reinigung und Kristallisation. Jedes Kapitel beschreibt den jeweiligen Prozess detailliert, inklusive der verwendeten Methoden, der Optimierung und der Bewertung der Ergebnisse.
Was ist das Ziel der Expressionsphase?
Ziel der Expressionsphase ist die Erzeugung einer ausreichenden Menge an Protein für die nachfolgenden Reinigungsschritte. Es wird die Expressionsstrategie, der Vektor, die Kultivierungsbedingungen und die Optimierung des Prozesses zur Maximierung der Proteinausbeute beschrieben.
Wie wird das exprimierte Protein gereinigt?
Die Reinigung des Proteins erfolgt mittels verschiedener chromatographischer Methoden. Die Arbeit beschreibt detailliert die einzelnen Reinigungsschritte, die Wahl der Säulenmaterialien und Pufferbedingungen. Die Wirksamkeit der Reinigung wird durch SDS-PAGE und andere analytische Methoden belegt. Das Ziel ist ein hochreines Proteinpräparat für die Kristallisation.
Wie wird die Kristallisation durchgeführt und optimiert?
Das Kapitel Kristallisation beschreibt verschiedene Methoden und Bedingungen, wie z.B. die Verwendung verschiedener Fällungsmittel und Temperaturvariationen. Der Fokus liegt auf der Optimierung der Bedingungen zur Bildung hochwertiger Kristalle für die Röntgenstrukturanalyse. Die Kristalle werden auf Qualität und Größe hin charakterisiert.
Welche Schlüsselwörter beschreiben die Arbeit?
Wichtige Schlüsselwörter sind: SH2-Domäne, Nck2, Adapterprotein, humane Zelle, Proteinreinigung, Proteinkristallisation, Expressionsoptimierung, Chromatographie, Röntgenkristallographie.
Wo finde ich detailliertere Informationen zu den einzelnen Schritten?
Die Arbeit enthält detaillierte Beschreibungen der einzelnen Schritte in den jeweiligen Kapiteln: Expression, Reinigung und Kristallisation. Diese Kapitel erläutern die verwendeten Methoden, Parameter und die erzielten Ergebnisse im Detail.
- Citation du texte
- Antje Carolin Schneider-Findeis (Auteur), 2004, Expression, Reinigung und Kristallisation der SH2-Domäne des humanen Adapterproteins Nck2, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/512433
