Identificación y caracterización de polimorfismos de hiperplexia en el gen SLC6A5 (GLYT2)

Examination Thesis , 2009 , 30 Pages , Grade: 9,5 sobre 10

Biology - Miscellaneous

La hiperplexia hereditaria es un síndrome clínico de baja prevalencia en la población, caracterizado por presentar una elevada respuesta a estímulos triviales, generalmente, acústicos y táctiles. Es una enfermedad compleja, cuyos defectos están relacionados con alteraciones en las vías glicinérgicas inhibitorias. Estas alteraciones están causadas por mutaciones en los genes GLRA1, GLRB, ARHGEF9, GPHN y SLC6A5, que codifican proteínas tanto de la neurona presináptica como de la neurona postsináptica. En este estudio se ha analizado el gen SLC6A5 que codifica el transportador de la glicina 2 (GLYT2) del DNA de 14 pacientes testados negativamente para mutaciones en el gen GLRA1, y se ha identificado una posible mutación puntual asociada a hiperplexia en el exón 15 de tres pacientes.

Identificación y caracterización de polimorfismos de hiperplexia en el gen SLC6A5 (GLYT2)

Resumen

La hiperplexia hereditaria es un síndrome clínico de baja prevalencia en la población, caracterizado por presentar una elevada respuesta a estímulos triviales, generalmente, acústicos y táctiles. Es una enfermedad compleja, cuyos defectos están relacionados con alteraciones en las vías glicinérgicas inhibitorias. Estas alteraciones están causadas por mutaciones en los genes GLRA1, GLRB, ARHGEF9, GPHN y SLC6A5, que codifican proteínas tanto de la neurona presináptica como de la neurona postsináptica. En este estudio se ha analizado el gen SLC6A5 que codifica el transportador de la glicina 2 (GLYT2) del DNA de 14 pacientes testados negativamente para mutaciones en el gen GLRA1, y se ha identificado una posible mutación puntual asociada a hiperplexia en el exón 15 de tres pacientes.

Palabras clave: Hiperplexia, glicina, neurotransmisión inhibitoria, transportadores de glicina.

Abreviaturas

HH: Hiperplexia hereditaria.

GLYT1 y GLYT2: Transportadores de glicina 1 y 2.

SLC6A5: Gen que codifica el transportador de la glicina 2.

GlyR, GlyRα1 y GlyRβ: Receptor de la glicina, subunidad α1 y subunidad β.

GLRA1: Gen que codifica la subunidad α1 del receptor de glicina.

GLRB: Gen que codifica la subunidad β del receptor de glicina.

GPHN: Gen que codifica la gefirina.

ARHGEF9: Gen que codifica la colibistina.

Introducción

Hiperplexia hereditaria

La hiperplexia hereditaria (OMIM 149400) es un síndrome clínico de baja prevalencia en la población, que se caracteriza por una excesiva respuesta a estímulos inesperados auditivos, visuales o somatosensoriales y rigidez muscular generalizada. Fue descrito por primera vez en el año 1958 por Kirstein y Silfverskiold, y posteriormente se han descrito dos formas clínicas distinguibles, la forma “major” y la “minor” (Suhren y col., 1966; Tijssen y col., 1995). La forma major se caracteriza por una respuesta de rigidez del tronco, puños apretados y frecuentes temblores seguidos de un entumecimiento generalizado durante unos segundos, manifestándose después del nacimiento incluso en periodo intrauterino. La forma major habitualmente se ha denominado como “síndrome del bebé entumecido”, o enfermedad del sobresalto. La forma minor, se diferencia de la major, en que no se produce entumecimiento generalizado después del sobresalto y nunca se manifiesta en periodo neonatal (Tijssen y col., 2002; Bakker y col., 2006).

Los recién nacidos que padecen hiperplexia hereditaria (HH) tienen un alto riesgo de muerte súbita debido a que la rigidez muscular puede producir fallos cardiorrespiratorios y espasmos laríngeos. Por otro lado, los síntomas pueden atenuarse con el tiempo, aunque los espasmos musculares exagerados provocados por diversos estímulos suelen persistir a lo largo de toda la vida, generando en el afectado inseguridad al caminar debido a la alta probabilidad de sufrir caídas repentinas. El desarrollo mental de los afectados suele ser normal (Tijssen y col., 1995).

Existen otros dos tipos de hiperplexia en las que los individuos afectos no presentan antecedentes familiares. Son la hiperplexia esporádica y la hiperplexia sintomática (Bakker y col., 2006). En la hiperplexia esporádica los síntomas clínicos que se manifiestan son, en la mayor parte de los casos, los mismos que en la forma major de HH. Además de estos síntomas, se ha descrito la aparición de ataques tónicos y cianosis en el periodo neonatal (Rivera y col., 2006), que pueden superarse mediante la flexión de la cabeza y las piernas sobre el tronco (Vigevano y col., 1989). La hiperplexia sintomática está relacionada con daños cerebrales o del tallo cerebral, cuyos síntomas clínicos son clasificados como la forma minor de HH (Bakker y col., 2006).

En la actualidad no existe tratamiento específico contra la HH pero, puesto que se piensa que durante el desarrollo lo que se produce es un efecto compensatorio que incrementa la neurotransmisión GABAérgica inhibidora para suplir la deficiencia de la glicinérgica inhibidora (ver después la relación entre las vías glicinérgicas inhibitorias y la HH), lo que se administra a los pacientes son fármacos para aumentar la eficacia de la neurotransmisión GABAérgica. Así, se pueden administrar barbitúricos o benzodiacepinas que son agonistas del receptor GABA A o bien inhibidores del transportador mayoritario de GABA (GAT1) como la tiagabina que aumentan el tiempo de permanencia del GABA en las sinapsis y por tanto la eficacia de la neurotransmisión inhibidora.

Neurotransmisión glicinérgica inhibidora

La glicina es un aminoácido que lleva a cabo numerosas funciones en el sistema central de mamíferos. Por un lado, es un neurotransmisor inhibidor que se encuentra en mayor proporción en zonas posteriores del sistema nervioso, como la medula espinal y el tallo cerebral. En estas regiones, las interneuronas glicinérgicas se encargan de la generación de ritmos motores y la coordinación de acciones reflejas espinales. Las interneuronas espinales de tipo Ia permiten la relajación de músculos antagonistas y la contracción coordinada de los músculos agonistas, mediando así circuitos reflejos de inhibición recíproca. Por último, las interneuronas de Renshaw regulan la excitabilidad de motoneuronas mediante un proceso de retroalimentación negativa, a través de inhibiciones recurrentes (Legendre, 2001).

Además de la función inhibidora, la glicina participa en las vías glutamatérgicas excitatorias, siendo necesaria para la activación de los receptores de N-metil-D- aspartato (NMDAR), actuando junto con el glutamato (Johnson y Ascher, 1987), así como también es necesaria para el reciclaje del NMDAR de la membrana plasmática. (Nonog y col., 2003).

El mecanismo de sinapsis inhibitoria se desencadena tras la llegada de un potencial de acción a la neurona postsináptica, generando una despolarización de la membrana del terminal sináptico, lo que conlleva a una apertura de canales de calcio dependientes de voltaje y la entrada de calcio a favor de gradiente electroquímico en el terminal presináptico. El calcio regula la exocitosis de las vesículas sinápticas (SSV) que contienen la glicina, siendo liberada a la hendidura sináptica. La glicina interacciona con los receptores de glicina (GlyR) de la neurona postsináptica activándolos, produciéndose la apertura del canal y la entrada de cloruro al interior. Como consecuencia de la entrada de cloruro, se produce la hiperpolarización de la membrana postsináptica, lo que conlleva a una inhibición de la neurona postsináptica. La glicina se retira del terminal sináptico por los transportadores situados en las células gliales (GLYT1) o en la neurona presináptica (GLYT2), mediante un transporte en contra de gradiente de concentración que utiliza el gradiente electroquímico de sodio como fuente de energía y además requiere la entrada simultánea de cloruro. Se trata, pues, de un cotransporte de glicina, sodio y cloruro. Los gradientes iónicos son mantenidos por la Na+/K+-ATPasa de membrana plasmática. Cuando la glicina se encuentra en el interior de la neurona presináptica se introduce de nuevo en las vesículas sinápticas mediante un transporte activo secundario que la intercambia por protones por la acción del transportador vesicular de aminoácidos inhibitorios (VIAAT, Christensen y col., 1991) sustentado por el gradiente electroquímico de protones generado por bombas H+- ATPasas vacuolares (Zafra y col., 1997; Figura 1).

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Figura 1. Esquema de una sinapsis glicinérgica inhibidora. El transportador vesicular de aminoácidos inhibidores (VIAAT) produce acumulación del neurotransmisor glicina (Gly) en vesículas sinápticas pequeñas (SSV) intercambiándolo por protones. Este antiporte es energizado por el gradiente de protones mantenido por H+ATPasas vacuolares. Tras despolarización del terminal y entrada de calcio, las SSV se fusionan con la membrana plasmática y liberan el neurotransmisor a la hendidura sináptica. Una vez que la glicina se une a receptores postsinápticos específicos (GLY-R), la acción sináptica del neurotransmisor es terminada por transportadores dependientes de sodio y cloruro GLYT1 (glial) y GLYT2 (neuronal). El estrecho acoplamiento al gradiente electroquímico de sodio de GLYT2 genera elevadas concentraciones de glicina en el terminal y proporciona sustrato al transportador vesicular VIAAT para el rellenado de las SSV. La activación de GLYR (receptor de glicina sensible a estricnina) por glicina abre un canal de cloruro en la proteína receptora que genera una corriente aniónica a la neurona postsináptica alejando su potencial de membrana del potencial de excitación y, por lo tanto, produciendo su inhibición (Figura obtenida de Giménez y col., 2008).

Neurona postsináptica

El receptor de la glicina es un canal de cloruro con un tamaño de poro de 5,2 Ǻ, constituido por cinco subunidades de tipo α, funcionales, y de tipo β, estructurales con una estequiometría de 3α:2β (Laube y col., 2002). Aunque estudios recientes sugieren una nueva estequiometría de 2α:3β (Grudzinska y col., 2005). Cada una de las subunidades está formada por un dominio amino terminal largo y un dominio corto carboxilo terminal, ambos en posición extracelular. Cuatro dominios transmembrana (TM1-TM4) con un largo dominio intracelular conectando TM3 y TM4 (Lynch, 2004). Las subunidades α del GlyR de vertebrados están codificadas por 4 genes distintos (GLRA 1-4), que por procesamiento alternativo (splicing) de los segmentos que codifican el dominio N-terminal extracelular y el dominio intracelular, generan las diferentes variantes de subunidades α del GlyR (Betz y Laube, 2006). Por otro lado, la subunidad β del GlyR, de mamíferos, está codificada por el gen GLRB. El dominio intracelular que conecta TM3 y TM4 es el lugar de anclaje de la gefirina (Meyer y col., 1995). La gefirina interacciona con componentes del citoesqueleto y proteínas como la profilina (Mammoto y col., 1998), RAFT1 (Sabatini y col., 1999) y la colibistina (Kins y col., 2000), formando un andamiaje (scaffold) postsináptico (Kneussel y Betz, 2000; Figura 2).

Una característica importante del GlyR, es su unión a estricnina muy cerca del sitio de unión a glicina. La estricnina es un alcaloide convulsionante antagonista de la glicina que se obtiene del árbol Strychnos nux vomica.

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Figura 2. Representación esquemática del receptor de glicina con su andamiaje postsináptico. La gefirina se une directamente a los GlyRs, en la subunidad β, y a los microtúbulos siendo esencial para la localización postsináptica de los GlyR (también, para los receptores del GABA, aunque no se muestran). Se une al PIP3 (fosfatidilinositol trifosfato) participando en la dinámica de ensamblaje de la actina y rutas de señalización celular junto con la profilina y la colibistina. La gefirina también interacciona con RAFT1, que es un candidato de regulación de la síntesis de proteínas de dendritas (Adaptado de Legendre, 2001).

Neurona presináptica

La acción de la glicina finaliza al ser retirada de la hendidura sináptica por transportadores de glicina (GLYTs) localizados en la membrana de la neurona presináptica y de células gliales colindantes, mediante un transporte activo acoplado al gradiente electroquímico de Na+ y dependiente de Cl-. El gradiente de Na+ necesario para proporcionar la energía al los GLYTs es mantenido por Na+/K+ ATPasas de la membrana plasmática (Eulenburg y col., 2005). Los GLYTs pertenecen a la familia de transportadores SLC6, que son transportadores de neurotransmisores dependientes Na+/Cl-, que incluye los transportadores de aminas biógenas (dopamina, noradrenalina y serotonina), del ácido γ-aminobutírico, GABA, transportadores de osmolitos (creatina, taurina, betaína) y aminoácidos como la glicina y la prolina. Además de una serie de transportadores sin sustrato conocido, que se han denominado “huérfanos”, muchos de los cuales transportan aminoácidos, como se va descubriendo en los últimos años (Chen y col., 2003).

Existen dos variantes de transportadores de glicina en el sistema nervioso central (SNC) de mamíferos, denominados GLTY1 y GLTY2 que difieren en cuanto a localización, funcionalidad y estequiometría. GLYT1 se localiza en astrocitos de regiones más rostrales del cerebro, médula espinal, tronco cerebral y cerebelo, relacionándose con vías glicinérgicas inhibitorias y excitatorias glutamatérgicas. Por otro lado, GLYT2 se localiza en áreas posteriores del SNC, cerebelo, tallo cerebral y médula espinal (Zafra y col., 1995). GLYT2, además sólo aparece en neuronas presinápticas glicinérgicas correlacionándose positivamente con la distribución del GlyR (Jursky y col., 1995).

Mediante la eliminación de los genes de GLYT1 (SLC6A9) y GLYT2 (SLC6A5) se ha determinado que la función de los GLYTs en la neurotransmisión glicinérgica inhibitoria es complementaria, donde GLYT1 es el regulador de los niveles de glicina en la hendidura sináptica, y GLYT2 transporta glicina hacia la neurona presináptica suministrando sustrato para el transporte vesicular que tiene baja afinidad (Km de VIAAT de orden mM; Gomeza y col., 2003 a y b).

Por otro lado, la estequiometría de GLYT2 es de 3Na+/1Cl-/1 glicina, lo que asegura el flujo vectorial de glicina hacia el terminal presináptico debido a que ejerce una fuerza impulsora del transporte dos órdenes de magnitud superior a la de GLYT1. Así, mantiene los niveles intracelulares de glicina elevados. Sin embargo GLYT1 presenta una estequiometría 2Na+/1Cl-/1 glicina, pudiendo exportar o importar glicina dependiendo de las condiciones fisiológicas (Roux y Supplisson, 2000).

Los transportadores de la familia SLC6 son proteínas politópicas con 12 dominios transmembranosos (TM1-TM12), conectados por seis lazos extracelulares y cinco intracelulares (EL). Los dominios amino y carboxilo terminales se sitúan en el interior celular. GLYT2 se caracteriza por presentar un domino amino terminal muy largo, de unos 200 aminoácidos. El domino EL2 que conecta TM3 y TM4 está altamente glicosilado, al igual que en GLYT1 (Eulenburg y col., 2005). La estructura tridimensional de los transportadores de glicina se ha determinado en base a la estructura cristalina del transportador de leucina de la bacteria Aquifex aeolicus (LeuTAa), que es una proteína homóloga a estos transportadores (Yamashita y col., 2005; Figura 3). Este transportador procariota no es dependiente de cloruro, en contra de lo que sucede con los transportadores eucariotas que requieren Cl- para el cotransporte de Na+ y el sustrato. Esta propiedad, de la que carecen los transportadores procariotas, parece haber sido adquirida posteriormente en la evolución mediante sustitución de residuos con carga negativa de la proteína (glutamatos) por residuos capaces de unir Cl- pero sin carga (serinas principalmente; Forrest, 2007; Zomot, 2007).

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Figura 3. Modelo de estructura secundaria (a) y modelo tridimensional (b) del LeuTAa en el que se basa la estructura de GLYT2. a) La proteína presenta una repetición estructural de topología invertida (TM1-TM5 y TM6-TM10). La interfase entre estas dos “repeticiones” forma el bolsillo de unión a los ligandos: el sustrato y dos iones sodio. La posición de la leucina y de los dos Na+ se señalan con un triángulo amarillo y dos círculos morados, respectivamente. b) Imagen tridimensional en el plano de la membrana en la que se observa los lugares de unión de los dos Na+ y la leucina (Yamashita y col., 2005).

Alteraciones en la neurotransmisión glicinérgica inhibitoria

Mediante la realización de estudios genéticos y generación de ratones Knock-out de genes relacionados con las vías inhibitorias glicinérgicas se ha visto que alteraciones en estas vías están relacionadas con la HH. Se determinó mediante análisis de ligamiento genético, que formas autosómicas dominantes de HH estaban relacionadas con regiones del brazo corto del cromosoma 5 (Ryan y col., 1992). Posteriormente se asociaron mutaciones del gen que codifica para la subunidad α1 del receptor de la glicina (GLRA1, 5q33.1) con formas dominantes y recesivas de HH (Shiang y col., 1993; Rees y col., 1994) y también en el gen que codifica para la subunidad β del receptor de la glicina (Rees y col., 2002). Se encontraron mutaciones en otras proteínas implicadas en la neurotransmisión glicinérgica inhibitoria, como la gefirina (Rees y col., 2003) y en la colibistina (Harvey y col., 2004). Por otro lado, la eliminación del gen de GLYT2 (SLC6A5) en ratones, puso de manifiesto un fenotipo similar al de la HH (Gomeza y col., 2003a). De este modo, alteraciones tanto en componentes presinápticos, como en componentes postsinápticos de las vías inhibitorias glicinérgicas generan HH.

Hiperplexia postsináptica

Las mutaciones encontradas en GLRA1, son en su mayoría, mutaciones puntuales o de cambio de aminoácido a codón de parada, generando una proteína truncada, y en menor medida de cambio en la pauta de lectura. Todas ellas producen un receptor inactivo o con una muy reducida afinidad por la glicina. Estas mutaciones, presentan rasgos autosómicos dominantes o recesivos, dependiendo de la situación de la mutación (Figura 4a). Las mutaciones dominantes puntuales asociadas al TM2, afectan al canal de cloruro, disminuyendo la afinidad de unión del ión. La sustitución de la arginina 271 por leucina o por glutamina (R271L; R271Q) genera una menor afinidad por los agonistas (Rajendra y col., 1994). Las mutaciones autosómicas recesivas son el resultado de la herencia de alelos mutados en familias consanguíneas o de la existencia de componente heterocigótico de la mutación. Los cambios de la tirosina 202, y la serina 296 (Y202X, S296X) producen una subunidad α1 truncada (Harvey y col., 2008). En la subunidad β del receptor de la glicina se han encontrado mutaciones recesivas con un componente heterocigótico claro, donde el cambio de una guanina a cinco pb en 5´ por una adenina en el intrón 5 (IVS5+G>A) heredado de la madre y el cambio de la glicina 229 por ácido aspártico (G229D) heredado del padre, generan hiperplexia (Rees y col., 2002; Figura 4b). De manera minoritaria, se han encontrado mutaciones para otras proteínas implicadas en la neurotransmisión glicinérgica situadas en la neurona postsináptica. Estas mutaciones se encuentran en menor proporción, y afectan a proteínas de interacción con el GlyR, como la gefirina, donde se ha descrito el cambio de la asparragina en posición 10 por una tirosina (N10Y) en el exón 1 de la proteína, produce el fenotipo típico de hiperplexia durante los primeros años de vida (Rees y col., 2003).

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Figura 4. Mutaciones en las subunidades α1 y β del receptor de glicina que causan hiperplexia. El esquema refleja la estructura secundaria de las subunidades α1 (a) y β (b), formadas por cuatros dominios transmembrana, unidos por lazos intra y extracelulares, con los extremo amino y carboxilo en posición extracelular. Se señala si la mutación es dominante (rojo), recesiva (azul claro) y mutaciones generadas en modelos animales (morado). (Figura obtenida de Harvey y col., 2008).

Hiperplexia presináptica

El análisis de los 16 exones del gen SLC6A5 (11p15.1) en pacientes con hiperplexia ha revelado que mutaciones puntuales y mutaciones de generación de codón de parada, y en menor medida de cambio de fase de lectura, generan hiperplexia, tanto hereditaria como esporádica, siendo el primer desorden neurológico asociado a mutaciones en un transportador dependiente de Na+/Cl-. Las mutaciones descritas hasta el momento producen todas ellas transportadores inactivos o con muy reducida capacidad de transporte. En la mayor parte de los casos se generan proteínas truncadas (mutaciones nonsense), como por ejemplo, el cambio de la glutamina 630 a un codón de parada (Q630X) en el TM10. Otras afectan al lugar de unión de la glicina, como es el caso del cambio del triptófano 482 por arginina (W482R) en el TM6 (mutaciones missense), y otras afectan al sitio de unión del Na+, como la mutación producida por el cambio de asparragina 509 por una serina (N509S) en el TM7. Para esta mutación se ha establecido un posible modelo el cual explica la disminución de la afinidad de GLYT2 por el Na+, en base al papel fundamental que desempeña la asparragina 509 interaccionando con el Na1 y el aumento de la distancia que se produce en esa interacción al sustituirse por una serina (Figura 5).

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Figura 5. Modelo de estructura propuesto de GLYT2 (a), de la interacción con Na1 (b) y de la sustitución N509S, que afecta a la afinidad por Na+ (c). a) Modelo de dímeros de GLYT2 humano con las hélices transmembrana (TM) distinguidas por colores. En cada monómero se indican la glicina y los iones sodio, con bolitas amarillas y azules, respectivamente. Unión del ión Na1 con el residuo N509 (b) y con el sitio conteniendo S509 (c). Se detallan los aminoácidos implicados en la unión del Na1 y Na2, y su posición en los TM1, TM6 y TM7. N509, localizado en el TM7, es capaz de interactuar con el Na1, mientras que S509 al estar a mayor distancia (3.4A°) no es capaz de hacerlo (Figura obtenida de Harvey y col., 2008).

La mayor parte las mutaciones son de carácter recesivo (Figura 6) encontrando únicamente el cambio de la serina 510 por una arginina (S510R) en el TM7 que presenta carácter dominante. Esta mutación provoca que se formen agregados citoplasmáticos de proteína (Harvey y col., 2008). Este polimorfismo se ha propuesto como dominante negativo del tráfico intracelular de GLYT2. Puesto que la asociación de dos a cuatro monómeros de GLYT2 parece crucial para la salida del transportador del retículo endoplasmático y su progresión hacia la membrana plasmática (Bartholomäus, 2008), si el transportador mutado S510R queda retenido en el retículo, los monómeros de transportador silvestre asociados con ellos, se verían también impedidos de llegar a la membrana generando el fenotipo de ausencia de transporte. A su vez las mutaciones pueden presentar carácter heterocigótico u homocigótico, aunque la mayoría muestran un carácter heterocigótico. Por ejemplo, la mutación causada por el cambio de la tirosina 377 a un codón de parada (Y377X, en el lazo extracitoplasmático de unión de TM3 y TM4), cuando está presente únicamente en el alelo paterno no genera fenotipo asociado a hiperplexia (autosómica recesiva, dado que si está presente en ambos alelos generan proteína truncada). La mutación de cambio de pauta de lectura donde la valina 432 se sustituye por fenilalanina, produciendo un cambio en la pauta de lectura que afecta a los siguientes 97 aminoácidos (V432F+fs97) situada en el TM5, presente únicamente en el alelo materno, causa un fenotipo parcial de hiperplexia, asociado a mioclonía nocturna. Cuando ambas mutaciones están presentes en el mismo individuo, generan alelos nulos, denominándose mutaciones con componente heterocigótico.

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Figura 6. Esquema de la estructura del GLYT2 según el modelo de LeuTAa, en el cual se han señalado los dominios transmembrana (1-12) y las conexiones entre éstos, así como su posición relativa. Se indican las mutaciones encontradas en pacientes con hiperplexia hereditaria y esporádica, y si son de carácter recesivo (azul clarito), dominante (rojo) y si se han generado en modelos animales (morado). (Figura obtenida de Harvey y col., 2008).

Se ha visto, que algunas mutaciones producen efecto dominante negativo, siendo este el caso de la mutación S510R, comentada anteriormente por ser la única mutación dominante encontrada. Por otro lado, la mutación producida por el cambio de la leucina 306 por una valina (L306V, en el lazo extracitoplasmático de unión de TM3 y TM4) no presenta deficiencias en el transporte de glicina, pero en casos en los que coexisten ambas mutaciones, el transporte queda abolido por completo (Rees y col., 2006; Eulenburg y col., 2006).

Como conclusión podemos decir que la hiperplexia es una enfermedad con heterogeneidad genética, caracterizada por presentar alteraciones en las vías glicinérgicas inhibitorias, tanto a nivel de proteínas de la neurona presináptica, como de proteínas de la neurona postsináptica.

Objetivo

De acuerdo con los antecedentes presentados en la introducción, en este trabajo nos proponemos el siguiente objetivo:

Identificación y caracterización de polimorfismos de hiperplexia en el gen SLC6A5, que codifica para el transportador de la glicina 2, en 14 pacientes de hiperplexia testados negativamente para mutaciones en la subunidad α1 del receptor de la glicina.

Material y métodos

La caracterización de polimorfismos de hiperplexia se ha realizado a partir del DNA genómico de 14 pacientes, facilitado por el Servicio de Genética del Hospital La Paz de Madrid (Dr. Lapunzina), testados negativamente para mutaciones en el gen 5q33.1 que codifica la subunidad α del receptor de la glicina (GLYRα1).

Amplificación y secuenciación: Se amplifican los 16 exones del gen SLC6A5 (11p15.1) a partir de DNA genómico de cada uno de los pacientes, utilizando los oligonucleótidos indicados en la Tabla 1, mediante la técnica de PCR con 60 ng de DNA genómico, 10 pmol de cada oligonucleótido (Sigma), 200 μM dNTPs, 0.5 U Taq polimerasa (Roche), buffer 1X en un volumen de final de 25 µl. Las condiciones seguidas son 35 ciclos a 94ºC durante 30s, 60ºC durante 30s y 72ºC durante 30s.

Tabla 1. Cebadores de oligonucleótidos sentido y antisentido utilizados para la amplificación de cada uno de los exones. Se indica el número y tamaño en pares de bases (pb) del exón, la secuencia de los cebadores utilizados, así como el tamaño de la secuencia que se amplifica.

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El análisis de los productos de la amplificación se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% donde, a partir del tamaño de los fragmentos obtenidos, y comparando con el tamaño del exón correspondiente, se corrobora que la amplificación ha sido correcta y se extrae el DNA de los exones amplificados con el kit de extracción de DNA en gel de agarosa (Quiagen). Finalmente, se secuencian la cadena 5´-3´ con el oligonucleótidos sentido y la cadena 3´-5´ con el oligonucleótido antisentido de cada uno de los exones y se realiza su análisis por el método de alineamiento de secuencias homólogas (BLAST).

Generación de posibles polimorfismos de hiperplexia en pcDNA3-rGLYT2 y pRC-CMV-hGLYT2: La mutación candidata encontrada en el exón 15 del gen SLC6A5 (ver resultados) se genera en el cDNA de GLYT2 de rata y humano introducidos en los plásmidos pcDNA3 y pRC-CMV, respectivamente, mediante la técnica de mutagénesis dirigida por PCR (QuickChange site-directed mutagenesis kit, Stratagene). Primeramente, se diseñan los oligonucleótido sentido y antisentido que introducirán los nucleótidos de interés para generar el cambio de tirosina a cisteína (Tabla 2). La PCR se lleva a cabo con 25 ng de pcDNA3-rGLYT2 ó pRC-CMV- hGLYT2, 62 ng de cada oligonucleótido, 0.05 U PfuTurbo DNA polimerasa, dNTPs mix (mezcla de los cuatro dNTPs) 10X, Buffer 1X y DMSO 5% en un volumen de reacción de 25 μl. Las condiciones seguidas son de 95ºC durante 30s, seguida de 18 ciclos de 95ºC durante 30s, 60ºC durante 1 min y 68ºC durante 7 min. El producto de la amplificación se digiere con 10 U de Dpn I, incubando a 37ºC durante 1 hora, para la digestión selectiva del DNA parental por reconocimiento de secuencias metiladas y hemimetiladas (5´-Gm6ATC-3´) y se selecciona así el DNA mutado. El análisis de los productos de la amplificación se lleva a cabo con una electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se secuencian los productos de la PCR con el fin de comprobar que el cambio de nucleótido se ha producido correctamente.

Tabla 2. Oligonucleótidos sentido y antisentido utilizados para la generación de la mutación sobre GLYT2 de rata y humano

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Se señala en rojo el cambio de nucleótido que introducimos para que se produzca el cambio de tirosina (TAT) a cisteína (TGT). s- oligonucleótido sentido; a- oligonucleótido antisentido; rY707C- mutación en rata; hY705C-mutación en humano.

Estudio de los posibles polimorfismos asociados a hiperplexia

Primeramente se genera mayor cantidad de DNA plasmídico mutado, para poder realizar los experimentos posteriores. Para ello se transforman 50 μl de la cepa de E.coli DH5α con 2 μl pcDNA3-rGLYT2-Y707C ó pRC-CMV-hGLYT2-Y705C, con una incubación de 30 minutos en hielo seguida de 1 min a 42ºC (choque térmico). Se siembran en placas de LB (medio Luria Bertani, 10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, 10 g/l NaCl) con ampicilina (50 ng/ml) se dejan crecer a 37ºC durante toda la noche. Se aíslan 4 colonias, que probablemente tendrán incorporado nuestro plásmido, y se crecen, independientemente, en 5 ml de medio LB con ampicilina (50 μg/ml) a 37ºC durante toda la noche. Se realizan glicerolados de cada uno de los cultivos crecidos (10 μl de cultivo con 100 μl de glicerol) y se almacenan a -70ºC. Se purifica el DNA plasmídico de los cultivos crecidos, siguiendo el protocolo de miniprep (Promega) y se secuencia para confirmar que contiene la mutación. Se crecen 20 μl del glicerolado del cultivo en el que hemos comprobado que se encuentra la mutación, en 100 ml de medio LB con ampicilina (50 ng/ml) en agitación a 37ºC durante toda la noche. Se purifica el DNA plasmídico de los cultivos crecidos siguiendo el protocolo de midiprep (Genomed).

1. Localización subcelular de GLYT2 mutado: expresión en células MDCK y técnica de inmunofluorescencia. En primer lugar, se realiza la transfección transitoria con liposomas catiónicos de células eucariotas en cultivo. Para ello, se crecen células MDCK (Madin-Darby canine kidney) a 37ºC y 5% CO2 en medio MEM de Eagle (Minimum Essential Medium) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) en pocillos de una p24 sobre cristales previamente tratados con poli-L-lisina. Cuando los cultivos presentan un 60-70% de confluencia se transfectan dos pocillos con 0.8 μg de pcDNA3-rGLYT2, otros dos con 0.8 μg de pcDNA3-rGLYT2-Y707C y en los últimos dos se realiza una cotranfección con 0.8 μg de pcDNA3-rGLYT2 y 0.8 μg de pcDNA3- rGLYT2-Y707C con Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Se incuban de 4 a 6 horas a 37ºC y 5% CO2 en MEM sin suero. Transcurrido ese tiempo, el medio se cambia por MEM con 10% FBS. Después de 48 horas, se realiza la inmunofluorescencia. Para ello, se lavan con PBS y se fijan con paraformaldheído al 4% (PFA) en PBS durante 15 minutos. Tras un segundo lavado en PBS, las células se bloquean con 10% de FBS y 0.02% de digitonina en PBS para permeabilizarlas. A continuación, las células se incuban con el anticuerpo primario, anti-GLYT2 de rata (Zafra y col., 1995), durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS con 0.1% de FBS. Tras tres lavados en PBS, se añade el anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo (Alexa 488), y se deja la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras otros tres lavados en PBS, se montan las preparaciones para su observación en el microscopio confocal empleando como medio de montaje Vectashield (Vector, Burlingame, CA, U.S.A). La visualización de las imágenes se realiza con el programa LSM Image Browser.

2. Funcionalidad de GLYT2 mutado: expresión en células COS-7 y transporte de glicina tritiada. En primer lugar se realiza la transfección transitoria con liposomas catiónicos de células eucarióticas en cultivo. Para ello, se crecen en tres p60 células COS-7 (American Type Culture Collection) en medio Eagle modificado por Dulbecco suplementado con 10% de FBS (DMEM/FBS) y se mantienen a 37ºC y 5% de CO2. Cuando los cultivos presentan un 60-70% de confluencia se les cambia el medio 30 minutos antes de realizar la transfección. Transcurrido ese tiempo se realiza la transfección con neofectina (Bio-Labs) donde una placa se transfecta con 2,5 µg de pcDNA3-rGLYT2 (ó pRC-CMV-hGLYT2) y 2.5 µg de pcDNA3 (ó pRC-CMV), otra placa con 2.5 µg de pcDNA3-rGLYT2-Y707C (ó pRC-CMV-hGLYT2-Y705C) y en la última placa se realiza una cotransfección con 2.5µg de pcDNA3-rGLYT2 (ó pRC- CMV-hGLYT2) y 2.5 µg de pcDNA3-rGLYT2-Y707C (ó pRC-CMV-hGLYT2- Y705C). Se incuban 5 horas a 37ºC y 5% CO2 en DMEM sin suero y transcurrido el tiempo, el medio se cambia por DMEM/FBS. Después de 24 horas, se traspasan las células de las p60 a un limbro de 24 pocillos, donde con cada p60 se cultivan ocho pocillos durante 24 horas en DMEM suplementado con 10% de FBS a 37ºC y 5% de CO2. Transcurrido ese tiempo, se realiza el experimento de transporte con glicina tritiada. De los ocho pocillos de cada transfección cuatro de ellos se utilizarán para un transporte sin inhibidor de GLYT2, donde en dos de ellos el transporte será a 5 minutos y en los otros dos a 10 minutos. En los cuatro pocillos restantes el transporte se realiza con inhibidor de GLYT2, para averiguar el transporte basal celular que nos permitirá normalizar los resultados posteriormente. El transporte se realiza también en 5 y 10 minutos. Para ello, se preparan dos medios radiactivos distintos con 3,5 ml de PBS completo (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM fosfato sódico dibásico, 2 mM fosfato potásico monobásico, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2 a pH 7.4.), 1 μl/ml de glicina fría (10 mM) y 2 μl/ml [H3]-glicina (PerkinElmer), de modo que la concentración final de glicina es 10 μM. A uno de los medios radiactivos se añade el inhibidor de GLYT2 (Org-25543) a concentración final de 1 μM. El transporte se realiza situando el limbro en un baño con agitación y a 37ºC. Primeramente, se elimina DMEM/FBS y se realiza un lavado con PBS completo. Tras el lavado se añade el medio radiactivo correspondiente en cada caso. Transcurrido el tiempo, 5 minutos en unos casos y 10 minutos en otros, se detiene el transporte lavando con PBS completo frío y retirando el medio líquido. Finalmente a los pocillos se les añaden 250 μl de NaOH 0.2M (desprenderá las células de la base del pocillo y solubilizará las proteínas). A continuación, se extraen alícuotas de cada pocillo para determinación de la cantidad de glicina-[H3] en un contador de centelleo (PerkinElmer, 100 µl de muestra y 3,5 ml de líquido de centelleo) y para la determinación de la concentración de proteína por el método de Bradford (Bio-Rad), midiendo la longitud de onda a 565 nm. El transporte de glicina debido a GLYT2 se mide como la diferencia de la acumulación de glicina observada en ausencia de inhibidor menos la observada en presencia del mismo, normalizada por la cantidad de proteína en el ensayo. Los resultados se expresan en nmoles de glicina /mg proteína/5 ó 10 min ó en porcentaje con respecto al control.

Resultados

En el análisis de la secuencia de los 16 exones del gen SLC6A5 (11p15.1) de los 14 pacientes de hiperplexia, testados negativamente para mutaciones en la subunidad α1 del receptor de la glicina (GLYRA1) por el grupo del Dr. Lapunzina (Hospital de La Paz), hemos hallado polimorfismos en secuencias codificantes, regiones 5´UTR y 3´UTR y regiones no codificantes ya descritos no asociados a hiperplexia (SNPs). Éstos se han encontrado mayormente en los exones 1, 2, 5, 7, 8, 10, 15 y 16 (Tabla 3).

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Tabla 3. Pacientes y exones del gen SLC6A5 con SNPs (single-nucleotide polymorphisms). Los SNPs son variaciones de la secuencia del ADN que ocurren cuando un solo nucleótido - A, T, C, ó G - en el genoma difiere entre los miembros de una especie (o entre los pares de cromosomas de un individuo). Se indica el paciente y todos los exones del gen SLC6A5 que presentan polimorfismos ya descritos no asociados a hiperplexia.

Asimismo, hay dos variedades de SNPs (single-nucleotide polymorphisms) hallados en los exones, los que están generados por un cambio de nucleótido que no produce variación de aminoácido (sinónimos o silentes), como por ejemplo la sustitución de la citosina 336 por una timina que no tiene efecto sobre la serina 112 (336C>T; S112S) en el exón 2. Por otro lado, hemos encontrado SNPs donde la sustitución del nucleótido produce un cambio de aminoácido (no sinónimos), por ejemplo, la sustitución de la timina 371 por una citosina, generándose un cambio de la fenilalanina 124 por serina (371T>C; F124S) en el exón 2 (sustitución missense; Tabla 4).

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Tabla 4. Resumen de SNPs que se encuentran en los distintos exones, (independientemente del paciente). Los SNPs subrayados son no sinónimos. C -citosina; T -timina; G-glicina; S-serina; L-leucina; F-fenilalanina; A-alanina; T-treonina; K- lisina; N-asparagina; D-ác. aspártico; E-ác. glutámico.

Por otro lado, hemos hallado dos SNPs ya descritos asociados a regiones no codificantes , en los pacientes 1758 y 3079 (Figura 7). Se trata de la sustitución de la citosina del intrón 14 a una distancia de tres pb en 3´, por una adenina (IVS14-3C>A) y en el paciente M92 la sustitución de la timina del intrón 15 a seis pb en 3´ por una timina (IVS15-6T>C). Estas mutaciones afectan a la secuencia consenso de ensamblaje entre los exones 14 y 15 y, aunque no parecen asociadas a hiperplexia al haberse encontrado en individuos sanos, no han sido caracterizadas previamente y podrían afectar al procesamiento del RNA de GLYT2.

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Figura 7. Representación esquemática de las mutaciones en la secuencia consenso de ensamblaje entre exones 14 y 15 en GLYT2 (pacientes 1758 y 3079). En la parte inferior se presenta un esquema de la secuencia consenso indicando las posiciones -1, -2 y -3 en el gen silvestre y en el mutado.

Además, hemos encontrado en el exón 15 del gen SLC6A5 un posible polimorfismo asociado a hiperplexia, de carácter heterocigótico, en los pacientes 3949, M117 y M123. Destacamos que estos pacientes además, presentan los mismos SNPs en el exón 2, sustitución de la glicina 102 por una serina y sustitución de la fenilalanina 124 por una serina (G102S y F124S). Estos pacientes no presentan ningún tipo de parentesco entre ellos. El candidato a polimorfismo asociado a hiperplexia es una sustitución de la tirosina 705 por una cisteína (Y705C), situada en el dominio transmembrana 11 (Figura 8).

La generación de la mutación mediante la técnica de mutagénesis dirigida en el cDNA de GLYT2 de rata es una primera aproximación al estudio de la funcionalidad y la localización subcelular del posible candidato a polimorfismo de hiperplexia. En el caso del GLYT2 de rata, la tirosina 707 es homóloga a la tirosina 705 del GLYT2 humano. Además, se hizo la misma mutación en el cDNA de GLYT2 humano.

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Figura 8. Representación esquemática de la posición del posible polimorfismo asociado a hiperplexia en la secuencia de DNA (a) en la estructura primaria de GLYT2 (b) y en la estructura secundaria de GLYT2 (c). a) Secuencia parcial del exón 15 del gen SLC6A5, donde se señala que en la posición 2114 (flechas negras) corresponde a una adenina (DNA control) y en los pacientes 3949, M117 y M123 corresponde a una adenina o una guanina, definiéndose así como un cambio heterocigótico. b) Secuencia de aminoácidos de GLYT2 humano, en la que se ha indicado en diferentes colores los aminoácidos que forman los dominios transmembrana (TM). Se ha señalado en negro la posición de la sustitución de la tirosina 705 por una cisteína. c) Esquema de la estructura secundaria de GLYT2, en el que se ha señalado (punto negro) en el TM11, la posición relativa del cambio de la tirosina por cisteína.

Hemos estudiado la localización subcelular rGLYT2-Y707C, mediante la utilización de anticuerpos anti-GLYT2 de rata (Zafra y col, 1995), y hemos contemplado marcaje en la membrana plasmática (Figura 9b). En la cotransfección, los experimentos preliminares indican que rGLYT2-Y707C no parece tener un efecto dominante negativo sobre el GLYT2-wt, dado que no se forman agregados citoplasmáticos patentes, y que visualizamos marcaje en la membrana plasmática (Figura 9c). La localización subcelular hGLYT2-Y707C no ha podido ser determinada por no disponer de buenos anticuerpos contra el parálogo humano.

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Figura 9. Localización subcelular por inmunofluorescencia de rY707C en células MDCK. a) Células transfectadas con pcDNA3-rGLYT2 (GLYT2-wt), donde se observa su localización en la membrana plasmática de las células de cultivo. b) Células transfectadas con pcDNA3-rGLYT2-Y707C, donde la localización de GLYT2 no varía con respecto al GLYT2-wt, siendo también en la membrana plasmática. c) Cotransfección con GLYT2-wt y rGLYT2-Y707C. No se observa una localización diferencial con respecto a a) y b).

En el estudio de la funcionalidad de rGLYT2-Y707C basado en el transporte con glicina-[H3] en células COS-7 se ha visto que presenta aproximadamente un transporte del 75% con respecto al GLYT2-wt (Figura 10). En la cotransfección de estas células el transporte se ve aumentado a un 90%, por lo que a priori podemos sugerir que no presenta un efecto dominante negativo con respecto al GLYT2-wt.

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Figura 10. Transporte de glicina-[H3] en células COS-7 transfectadas con GLYT2-wt e Y707C. a, b) rata. c, d) humano. a),c) Transporte de glicina en tiempos de 5 y 10 minutos (time course). Con el transcurso del tiempo en todos los casos el transporte de glicina va aumentando, siendo mayor en el GLYT2-wt, y menor en los mutantes. b) y d) Transporte de glicina en términos de porcentaje, tomando como referencia un 100% de transporte en el GLYT2-wt. El transporte con los mutantes es del 75%, mientras que en la cotransfección con ambos, y en ambos casos, es de un 85%.

Asimismo, en el análisis de la secuencia del SLC6A5 se han encontrado sustituciones de nucleótidos en regiones no codificantes de diversos pacientes (Tabla 5). Destacamos una inserción en la región 3´UTR del exón 16 en el paciente M127. Estas sustituciones no han sido descritas anteriormente.

Tabla 5. Sustituciones de nucleótidos halladas en el análisis de la secuencia del gen SLC6A5 de 14 pacientes de hiperplexia, situadas en regiones no codificantes.

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Se indica el número del intrón, el cambio producido en él, y los pacientes en los que aparece dicho cambio. IVS- Intrón; C- Citosina T-timina G- guanina; A-adenina

Discusión

En el análisis de polimorfismos de hiperplexia en el gen SLC6A5, que codifica para el transportador de la glicina 2, en 14 pacientes de hiperplexia testados negativamente para mutaciones en la subunidad α1 del receptor de la glicina, hemos hallado un posible polimorfismo asociado a hiperplexia, consistente en una mutación puntual, donde la tirosina 705 se sustituye por una cisteína (Y705C), localizándose en el TM11. Es una mutación puntual heterocigótica, encontrada en tres pacientes no emparentados.

La generación de la mutación mediante la técnica de mutagénesis dirigida en el cDNA de GLYT2 de rata nos ha permitido una primera aproximación en el estudio de los efectos producidos por la mutación en la localización subcelular y la funcionalidad de GLYT2 de rata, que es homólogo al GLYT2 humano. También la generación de la mutación sobre el cDNA de GLYT2 humano nos ha permitido abordar su capacidad de transporte.

Con los resultados obtenidos en este estudio preliminar, que muestran una localización subcelular en membrana del GLYT2 mutado y un transporte próximo al transporte realizado por el GLYT2 salvaje, no podemos determinar que esta mutación puntual sea la causante del fenotipo asociado a hiperplexia en estos tres pacientes. No obstante, estudios que se encuentran en la actualidad en marcha en el laboratorio han hallado un comportamiento diferencial entre GLYT2-wt y rY707C respecto al efecto de la chaperona de retículo endoplasmático calnexina que asiste la biosíntesis del transportador. Mientras que la sobrexpresión de calnexina en células que coexpresan GLYT2 presenta una correlación negativa sobre la expresión y el transporte de GLYT2wt, esta misma sobrexpresión tiene una correlación positiva en la expresión y el transporte del mutante. Esto sugiere que quizá el mutante sí presenta defectos de tráfico y que habrá que optimizar el tipo o el sistema de ensayo para poder detectarlos. Por ejemplo, la utilización de construcciones de GLYT2wt y mutante marcados con distintos epítopos, podría ayudar en el estudio de la posible formación de oligómeros entre wt y mutante que podrían estar a la base de una retención en algún punto de la vía secretora en la biogénesis de GLYT2. Para ello, habría que diseñar experimentos de pulso y caza para estudiar comparativamente el time course de expresión de wt y mutante. La utilización del sistema celular de MDCK debería también optimizarse ya que estas células, por el hecho de estar polarizadas, tienen una maquinaria de tráfico más parecida a la de otras células polarizadas como las neuronas. De hecho, GLYT2 presenta una distribución exclusivamente apical en estas células (Martínez-Maza y col., 2001), al igual que muchas proteínas de localización axonal como GLYT2. Los ensayos que se han llevado a cabo en MDCK no permiten distinguir entre localización apical o basolateral pero sería muy interesante el estudio del tráfico del transportador wt y mutante hacia la membrana apical o basolateral una vez polarizadas las células.

En estudios anteriores, se han identificado un elevado número de polimorfismos (SNPs) asociados a las regiones codificantes y no codificantes del gen SLC6A5 (Ress y col., 2006). Dado que los pacientes en los cuales hemos encontrado la mutación puntual no presentan parentesco alguno, existe la posibilidad de que sea un polimorfismo no asociado a hiperplexia que aún no se haya descrito. Para poder desechar esta posibilidad, sería necesario un análisis de diversos DNA control de individuos pertenecientes a la misma población, que no padezcan hiperplexia.

Sin embargo, el hecho de encontrar en estos tres pacientes los mismos cambios en el exón 2, la glicina 102 por serina y la fenilalanina 124 por serina (G102S; F124S) y que en ambos casos son dos sustituciones no equivalentes de aminoácidos, nos hace sospechar de un posible componente heterocigótico de las mismas, como ocurre en varios casos descritos anteriormente, donde la presencia de un único polimorfismo no genera el fenotipo de hiperplexia y la combinación de varios polimorfismos sí. (Rees y col., 2006; Eulenburg y col., 2006). El abordaje experimental del estudio de los efectos de la combinación de estas mutaciones, sería realizando mutantes combinados mediante la técnica de mutagénesis dirigida, con el consecuente diseño de oligonucleótidos específicos de introducción del nucleótido de interés para sustituir el aminoácido. Una vez generados los mutantes, sería interesante estudiar si se genera una nueva localización subcelular en forma de agregados citoplasmáticos. También habría que estudiar la funcionalidad de GLYT2, mediante experimentos de transporte para ver si el efecto de las combinaciones de mutaciones afecta al transporte de glicina. Asimismo, sería interesante estudiar combinaciones de algunos de los SNPs ya descritos en individuos sanos como por ejemplo el que afecta a la secuencia consenso de ensamblaje entre exones por ver si el componente heterocigoto es decisivo en la aparición del fenotipo (ver más adelante).

Por otro lado, y debido a la heterogeneidad genética que presenta la hiperplexia hereditaria, tanto a nivel de proteínas de la neurona presináptica como de proteínas de la neurona postsináptica en las vías glicinérgicas inhibitorias, es posible que estos 14 pacientes testados negativamente para mutaciones en GLRBA1, sufran mutaciones en otros genes implicados en estas vías. Algunos candidatos ya descritos serían el gen que codifica la subunidad β del receptor de la glicina, GLRB (Rees y col., 2002), gen GPHN que codifica la gefirina (Rees y col., 2003) y el gen ARHGEF9 que codifica la colibistina (Harvey y col., 2004), presentes en la neurona postsináptica de vías inhibitorias glicinérgicas.

Se han descrito casos de hiperplexia esporádica donde no existen mutaciones en los genes GLRA1, GLRB, ARHGEF9, GPHN y SLC6A5, lo que sugiere que debe haber otros genes de las vías glicinérgicas inhibitorias implicados en la hiperplexia hereditaria, realzándose aún más la heterogeneidad genética de esta enfermedad. Dado que en la neurona presináptica sólo se han descrito mutaciones en el gen SLC6A5 (Rees y col., 2006; Eulenburg y col., 2006). Los posibles candidatos podrían ser genes que codifican proteínas de interacción con GLYT2 y genes de proteínas de la neurona presináptica implicadas en la neurotransmisión glicinérgica.

El transportador vesicular de glicina, VIAAT, está localizado en la neurona presináptica tanto de neuronas GABAérgicas como glicinérgicas. Está codificado por el gen SLC32A1 (20q11.23) y su función es rellenar las vesículas sinápticas de glicina y GABA, de modo que alteraciones en este transportador provocarían alteraciones en las vías glicinérgicas. La proteína ULIP6 es una fosfoproteína codificada por el gen DPYSL5 (2p23.3). Es una proteína específica de cerebro que interacciona con GLYT2 por el dominio aminoterminal intracelular, siendo un proceso dependiente de fosforilación. Su función está relacionada con la inserción y el reciclaje de GLYT2 de la membrana. Mutaciones en el gen DPYSL5, afectarían a los niveles de GLYT2 en la membrana celular, lo que alteraría la cantidad de glicina en el interior de la neurona presináptica suponiendo una alteración en la neurotransmisión glicinérgica. La proteína sintenina-1, codificada por el gen SDCBP (8q12.1), presenta dominios PDZ de interacción específica con GLYT2, y la unión a ésta puede estar involucrada en la localización presináptica de GLYT2 o regulando el tráfico intercelular (Harvey y col., 2008). La proteína sintaxina 1A, codificada por el gen HPC-1 (7q11.2), está implicada en la regulación del número de transportadores de GLYT2. (Giménez y col., 2008; Figura 11).

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Figura 11. Esquema de una neurona presináptica de vías inhibitorias glicinérgicas, donde están representadas las proteínas candidatas a estar involucradas en la hiperplexia dada su interacción con GLYT2, o por ser esenciales para el correcto funcionamiento de esta neurotransmisión, como es el caso del trasportador vesicular (VIAAT). La sintaxina 1A, tras la entrada de Ca+2 en el terminal sináptico, interaccionaría con GLYT2, para dirigirlo a la membrana. La sintenina podría estar implicada en el posicionamiento de GLYT2 en la membrana. Una vez finalizada la acción de GLYT2, ULIP6 sería la encargada de producir la endocitosis de los transportadores para su reciclado. Diversas proteínas motoras se encargarían del tráfico intracelular de GLYT2. (Figura obtenida de Eulenburg y col., 2005).

Finalmente, comentar que no se ha realizado ningún estudio de las mutaciones encontradas en regiones no codificantes no descritas con anterioridad. Un posible abordaje experimental de estás mutaciones, sería comprobar si producen alteraciones en el procesamiento alternativo (splicing). Existen páginas web que analizan los posibles sitios de splicing y el efecto de variaciones sobre los mismos, aunque el mayor inconveniente es que no diferencian entre un verdadero sitio de splicing y un posible sitio de splicing (que el propio programa propone) , pero pueden ser útiles para obtener una primera aproximación a posibles candidatos de splicing.

Por otro lado, para estudiar si una mutación en un intrón afecta al splicing también podría realizarse experimentos in vivo, a partir de la generación de minigenes, estudiando su expresión en células en cultivo. Los minigenes son construcciones pequeñas de genes, que en nuestro caso serían híbridos entre dos exones y una parte del intrón que queremos estudiar (unos 200 pb), en el cual se introduce la mutación por técnicas de mutagénesis dirigida. Una vez generado el minigen dentro de un vector de expresión, se transfectan células transitoriamente y se estudia el ARN maduro producido por el minigen, realizando su extracción y la técnica de retrotranscripción inversa (RT-PCR) con oligonucleótidos que hibriden con la secuencia completa que hemos amplificado. Luego se analizaría mediante un gel de agarosa, y si la mutación generada afectara al splicing encontraríamos diferencias con respecto al salvaje, para el cual se tiene que seguir el mismo proceso de elaboración del minigen pero sin introducir la mutación (Baralle y Baralle, 2005). Estos abordajes nos permitirán avanzar el conocimiento a nivel molecular de la hiperplexia.

Como conclusión podemos afirmar que la hiperplexia hereditaria es una enfermedad genética compleja ligada a las vías de neurotransmisión glicinérgica inhibitoria, en la que están implicados genes como GLRA1, GLRB, ARHGEF9, GPHN y SLC6A5, existiendo también otros posibles genes candidatos. En el estudio del gen SLC6A5 de estos 14 pacientes, sólo en tres de ellos hay indicios de una posible relación de este gen con la enfermedad, siendo necesarios experimentos adicionales para poder confirmar que las mutaciones de este gen son las causantes de generar el fenotipo asociado a hiperplexia.

Agradecimientos

Agradecer a Francisco Moreno haber sido tan amable conmigo contestando a mis mails, ya que gracias a él puede conocer a Beatriz López Corcuera, a la cual le doy las gracias por haberme dado esta gran oportunidad.

A KiKe, Inma, Noe, Espe y Enri por estar ahí siempre que tenía alguna duda y ayudarme en todo lo que han podido.

A J.J por cederme su ordenador tantos días y tantas horas, sin ese detalle, el análisis de secuencias no hubiera sido lo mismo.

A Jaime y a Gonzalo por compartir con conmigo esta labor investigadora, por todo lo que me han ayudado y enseñado, por todos esos días de incertidumbre de resultados de PCR. Y agradecer a Gonzalo sus clases de mutagénesis dirigida, análisis de secuencias, explicación de protocolos y, como no, estar siempre ahí en el momento de poner en marcha la máquina de PCR.

A Bego, Aroa, Raquel y Bernardo por darme tanto apoyo moral, gracias a ellos, los momentos más difíciles fueron más fáciles.

A Charlie, por haber tenido ese bonito detalle conmigo, y por todas esas conversaciones de las cuales sacamos teorías muy interesantes, a la vez que absurdas.

Y por último a mi familia, que tanto me ha apoyado y ha creído en mí siempre, gracias a ellos he podido estudiar lo que siempre he querido, no perder mi motivación y en muchos momentos sacar fuerzas de donde no las había para continuar en esto.

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• College: Universidad Autónoma de Madrid (Centro de Biología Molecular Severo Ochoa)
• Course: 5
• Grade: 9,5 sobre 10
• Author: Jennifer Mayordomo-Cava (Author)
• Publication Year: 2009
• Pages: 30
• Catalog Number: V506081
• ISBN (eBook): 9783346056269
• Language: Spanish; Castilian
• Tags: Neurociencia, Biomedicina, Hiperplexia, glicina, neurotransmisión inhibitoria, transportadores de glicina