Sorption natürlicher Östrogene im Batchexperiment

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Material und Methoden
2.1 Chemikalien
2.2 Bodenmaterial
2.3 Batchexperimente
2.4 Bestimmung der Östrogene
2.4.1 Probenaufbereitung
2.4.2 GC-MS Messmethode

3. Ergebnisse und Diskussion
3.1 Batchlösungen
3.2 Einzelbestimmungen
3.3 Gemische

4. Zusammenfassung und Schlussfolgerung

5. Literatur

1. Einleitung

Hormone menschlichen oder tierischen Ursprunges gelangten tausende von Jahren mit steigender Tendenz durch Populationswachstum und intensivere Landnutzung in die Umwelt. Eine Verbindung zwischen ihnen und nachteiligen Effekten auf die Tierwelt und Menschheit wurde jedoch nie erkannt.

Hormone können über mehrere Wege in die Umwelt gelangen: durch die Landwirtschaft in Form von Pestiziden, Wirtschafts- und Sekundärrohstoffdünger (z.B. natürliche Östrogene, Mastförderer), durch Industrie- und Siedlungsabfälle. Gelangen sie über das Sickerwasser ins Grundwasser oder in Oberflächengewässer, können sie dort in Wirkmengen von wenigen ng/l z.B. eine Verweiblichung der Fischpopulation verursachen [1, 2].

Beim Menschen kann die Freisetzung der Hormone in die Umwelt zu einer Senkung der Spermazahl, zu einem Anstieg von Hoden-, Prostata- und Brustkrebs und zu Reproduktionsstörungen bei Männern führen [3].

Ein Problem ist die Vielzahl der Substanzen, die als endokrine Disruptoren wirken können. Sowohl Pestizide, Kosmetika, Medikamente, Farben etc. aber auch natürliche Steroide gehören dazu, wenn sie ungezielt in die Umwelt gelangen. Sie wirken unterschiedlich: die einen lösen aufgrund von Strukturähnlichkeiten zu bestimmten Hormonen im Organismus diejenigen Reaktionen aus, für die die entsprechenden Hormone zuständig wären, andere docken an Hormonrezeptoren an und verhindern so deren Wirkung, während eine dritte Kategorie Synthese, Transport oder Ausscheidung von Hormonen blockiert.

Diese Arbeit steht vor dem Hintergrund, dass jährlich etwa 2,4 g Gesamtöstrogenen pro Hektar mit Milchviehgülle auf landwirtschaftlich genutzte Flächen ausgebracht werden.

Anhand von Batchexperimenten (Schüttelversuchen) soll geklärt werden, ob und wie schnell natürliche Östrogene an Bodenmaterial gebunden werden können. Die Ergebnisse liefern Hinweise auf das Umweltgefährdungspotential, wie z.B. die Gefährdung des Grundwassers durch Auswaschung nicht retardierter und/oder abgebauter Östrogene.

2. Material & Methoden

2.1 Chemikalien

Für diese Untersuchung wurden die vier bedeutensten natürlichen Östrogene 17α-, β-Östradiol, Östriol und Östron wurden ausgewählt.

Zur Verhinderung eines Abbaus wurde das Atmungsgift Natriumazid (Merck, Deutschland) den Batchexperimenten zugegeben.

Als Wiederfindungsstandard wurde 2fach deuteriertes 17β-Östradiol bei der Probenaufbereitung hinzugefügt. Man geht davon aus, dass die deuterierte Substanz sich während der Probenaufbereitung und Messung ähnlich wie die nicht deuterierte Substanz verhält. Mit der Wiederfindung der deuterierten Substanz kann man somit die Messwerte der nicht deuterierten Substanz korrigieren.

Das Pestizid Mirex® wurde als Gerätestandard zur Korrektur messtechnischer Variationen verwendet.

Alle Lösungsmittel (Acetonitril, Aceton, Dichlormethan, Hexan, Toluol (Merck, Deutschland)) hatten HPLC Grad oder höher.

Als Derivatisierungsreagenz wurde N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluor-acetamid (MSTFA) eingesetzt. Wenn nicht anders vermerkt wurden die genannten Chemikalien von Sigma Aldrich (Deutschland) bezogen.

2.2 Bodenmaterial

Bei dem verwendeten Boden handelt es sich um Material aus dem Ap-Horizont einer Parabraunerde aus landwirtschaflicher Nutzung. Es wurde auf eine Körnung

< 2mm gesiebt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Physikalische und chemische Eigenschaften des Bodenmaterials

2.3 Batchexperimente

In 75 ml Zentrifugengläser mit lösungsmittelfestem Schraubdeckel wurden 10g des Bodenmaterials eingewogen und mit 50 ml Batchlösung versetzt.

Als Batchlösungen wurden eine 10-3M Natriumazidlösung mit je 0,1µg/ml 17α-, 17β-Östradiol, Östriol und Östron und eine Mischung aus 17α-, 17β-Östradiol und Östron (je 0,1µg/ml) verwendet. Der tatsächliche Gehalt der Batchlösungen wurde in zwei Proben, die direkt vor Zugabe zum Experiment aus dem Vorratsgefäß entnommen wurden bestimmt. Das Natriumazid sollte dabei den aeroben Abbau der Steroide verhindern. Die verschlossenen Gläser wurden bei 150 rpm für 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, 1d, 2d, 4d, 8d und 16d in einem Horizontalschüttler geschüttelt. Jedes Experiment wurde dreifach ausgeführt.

2.4 Bestimmung der Östrogene

2.4.1 Probenaufbereitung

Nach Ablauf der Schütteldauer wurden die Gefäße 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert; hierbei musste zügig gearbeitet werden, um eine weitere Hormonsorption an die Bodenprobe zu verhindern. Die Zentrifugation wurde bei Bedarf wiederholt. Aus dem Überstand wurden 40ml abpipettiert und bei 4°C gelagert, wenn sie nicht direkt weiter bearbeitet werden konnten.

Die Proben aus den Batchexperimenten wurden über eine Festphase (C18 Material, 3ml, Baker, Deutschland) aufkonzentriert. Dabei wurde das Sorbens zunächst mit Methanol von eventuell vorhandenen Verunreinigungen befreit und danach mit H2O dest. konditioniert. Die Proben wurde anschließend mit 100µl 17β-Östradiol-d2 (10µg/ml) versetzt und per Reservoir auf die Säule aufgegeben. Das Durchlaufen der Säule wurde mit schwachem Unterdruck einer Wasserstrahlpumpe beschleunigt.

Vor der Elution der Östrogene mit 10 ml Aceton:Dichlormethan (1:1) wurde die Festphase gründlich ausgesaugt und zusätzlich mit Stickstoff 2h getrocknet.

Die Eluate wurden ebenfalls unter sanftem N2 Strom vollständig eingetrocknet (Dauer etwa 2h). Proben der Ausgangsbatchlösungen wurden mit 1µg 17β-Östradiol-d2/250µl Acetonitril versetzt und bis zur Trockene einrotiert. Die in Acetonitril gelösten Östrogenstandards in Konzentrationen von 0,01 bis 1 µg/ml zur externen Kalibrierung der Messung wurden direkt unter Stickstoff eingetrocknet.

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