Der Fokus in dieser Diplomarbeit ist auf die Enzymklasse der Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) gerichtet. Durch das humane Genom Projekt wurden 57 aktive CYP Gene identifiziert, die anhand ihrer Sequenzidentität in 18 Proteinfamilien (CYP1-51) und 43 Proteinsubfamilien (CYP1A etc.) eingeteilt wurden.
Die Wissenschaft der Pharmakologie beschäftigt sich mit den Wechselwirkungen zwischen Arzneistoffen und dem Organismus. Teilgebiete der Pharmakologie sind die Pharmakodynamik, Pharmakokinetik und die Pharmakogenetik. Die Pharmakokinetik ist eng mit der Pharmakodynamik verknüpft und analysiert die Aufnahme (Absorption), die Verteilung (Distribution), die Metabolisierung (Metabolism) und die Ausscheidung (Excretion). In der Pharmakologie werden diese Prozesse unter dem Begriffe ADME zusammengefasst.
Die Pharmakodynamik beschäftigt sich dabei mit der Dosis-Wirkungsbeziehung des Arzneimittels und damit verbundene mögliche Arzneimittelnebenwirkungen. Die interindividuelle Variabilität der Arzneimittelwirkung und der damit verbundenen Nebenwirkungen hängen von Patienten-Faktoren (Alter, Geschlecht, Hormonstatus etc.), den gegebenen Umwelteinflüssen (Ernährung, Komedikation etc.) und von der unterschiedlichen genetischen Ausstattung der Patienten ab. Die Pharmakogenetik analysiert genetischen Faktoren und ihre Auswirkungen auf die Pharmakodynamik und -kinetik.
Im Zeitalter der Hochdurchsatz-Sequenzierungen (next-generation-sequencing) und Voranschreiten der personalisierten Medizin werden vermehrt Unterschiede in der genetischen Grundausstattung des Menschen identifiziert. Dabei handelt es sich oftmals um Einzelnukleotidaustausche (single nucleotide polymorphisms, SNPs), die bei den sogenannten nicht-synonymen Polymorphismen (nsSNPs), zu einem Aminosäureaustausch des Proteins führen. Dies kann unter Umständen zur interindividuellen Variabilität im Arzneistoffwechsel beitragen. Neben den Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren und Ionenkanälen sind für die Pharmakogenetik vor allem Membranproteine der P-Glykoprotein/ABC-Transporterfamilie (MDR-Proteine) und die arzneimittelabbauenden Enzyme der Phase I und – II von besonderem Interesse.
Inhaltsverzeichnis
- ZUSAMMENFASSUNG
- 1. EINLEITUNG
- Pharmakologische Forschung in der Post-Genom Ära
- Arzneimittelmetabolismus durch humane Cytochrom P450 Enzyme
- Die Cytochrom P450 Monooxygenase 2B6
- Sequenz- und Struktur-Funktionsbeziehungen von P450 Enzymen
- Genotyp-Phänotyp Vorhersagen von nicht-synonymen SNPs
- Rekombinante Expression humaner P450 Enzyme
- Aufgabenstellung und Motivation
- 2. ERGEBNISSE
- Analyse neuer CYP2B6 Varianten ruandischer HIV Patienten
- Validierung von in silico Phänotyp Vorhersagen aufgrund experimenteller CYP2B6 Daten
- Phänotyp Vorhersagen der neuen CYP2B6 SNPs
- Sequenz und Struktur- Funktionsanalyse von CYP2B6
- Rekombinante Expression von nativem CYP2B6 in E. coli „Walker Stämmen“
- Expression in E. coli C41 und C43 mit dem Expressionsvektor pLW01
- Quantifizierung des P450 Gehaltes in den Kulturen
- Bestimmung der CYP2B6 Bupropionhydroxylase-Aktivität mittels LC-MS
- Expression des ortholgen CYP2B4 in E. coli C41
- Vergleich der Bupropion-Hydroxylase Aktivität von CYP2B4 und CYP2B6
- Fraktionierung und Verteilung des exprimierten CYP2B6 im E. coli Lysat
- Das E. coli pET SUMO Expressionssystem
- Expression von SUMO-CYP2B6 und N-terminalen Varianten
- Fraktionierung von pET-SUMO exprimiertem CYP2B6
- Aufreinigung von SUMO-CYP2B6del mittels Magnetic Beads
- Fazit der Expression von CYP2B6 in E. coli
- Expression und Charakterisierung der neuen CYP2B6 Varianten
- Expression der Varianten CYP2B6.G110V, -I114T, -V183G und CYP2B6.6 in E. coli C41
- Bupropionhydroxylase-Aktivität der in E. coli C41 exprimierten Varianten
- Expression der neuen CYP2B6 Varianten in COS-1 Zellen
- Bupropionhydroxylase-Aktivität der in COS-Zellen exprimierten Varianten
- Enzymparameter der CYP2B6.R253H, -R487S und CYP2B6.6 Varianten
- Analyse neuer CYP2B6 Varianten ruandischer HIV Patienten
- 3. DISKUSSION
- Validierung der CYP2B6 Phänotyp Vorhersagen
- In silico Analyse neuer CYP2B6 Varianten in ruandischen HIV Patienten
- Expression von membrangebundenem CYP2B6 in E. coli C41
- Aktivität des nativen CYP2B6
- PET-SUMO Expressionssystem in E. coli zur Expression von nativem P450 Enzymen
- Zusammenfassung der in vitro und in silico Analyse neuen CYP2B6 Varianten
- Ausblick
- 4. MATERIALIEN UND METHODEN
- Experimentelle Arbeiten
- Klonierung von CYP2B6 in pLW01
- Konstruktion der pET-SUMO-2B6 Expressionsvektoren
- Ortspezifische Mutagenese der neuen CYP2B6 cDNA Varianten
- Expression in E. coli
- Zellaufschluß und Zentrifugationsschritte
- Aufreinigung der SUMO-CYP2B6 Proteine mit der Magentic Beads Technologie
- Rekombinante Expression von CYP2B6 in COS-1 Zellen
- Western Blot
- Reduzierte CO-Differenzspektroskopie zur Quantifizierung von exprimiertem CYP2B6
- LC/MS Analyse
- In silico Arbeiten
- Datenbanken
- PCR, DNA Sequenz Tools
- Protein Primär- und Tertiärstruktur Tools
- Online Genotyp-Phänotyp Vorhersage Programme
- Experimentelle Arbeiten
- 5. LITERATURVERZEICHNIS
- 6. ANHANG
- 7. ARBEITSGRUPPEN
- AG Zanger
- AG Pleiss
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der pharmakogenetischen Analyse neuer CYP2B6 Varianten. Die Untersuchung der interindividuellen Medikamentenverträglichkeit durch CYP2B6 Polymorphismen ist besonders in der HIV Therapie relevant, da Efavirenz und Nevirapin, zwei wichtige anti-HIV Medikamente, durch CYP2B6 metabolisiert werden. Die Arbeit untersucht die Auswirkungen neuer CYP2B6 Varianten auf die Enzymaktivität, insbesondere in Bezug auf die Metabolisierung von Bupropion. Die Studie kombiniert in silico Analysen mit experimentellen in vitro Untersuchungen, um die Funktionalität der neuen Varianten zu charakterisieren.
- In silico Vorhersage und Validierung von Genotyp-Phänotyp Beziehungen
- Sequenz- und Struktur-Funktionsanalyse neuer CYP2B6 Varianten
- Rekombinante Expression von nativem CYP2B6 in E. coli
- Charakterisierung der Enzymaktivität neuer CYP2B6 Varianten in vitro
- Klinische Relevanz der identifizierten CYP2B6 Varianten für die HIV Therapie
Zusammenfassung der Kapitel
Die Arbeit beginnt mit einer Einleitung, die den aktuellen Stand der Forschung im Bereich der Pharmakogenetik beleuchtet. Sie beschreibt die Bedeutung von Cytochrom P450 Enzymen für den Arzneimittelmetabolismus und die Auswirkungen von Polymorphismen in den CYP Genen. Anschließend stellt die Arbeit die Cytochrom P450 Monooxygenase 2B6 und ihre Rolle in der Metabolisierung von Medikamenten, insbesondere in der HIV Therapie, vor. Die Einleitung führt in die Aufgabenstellung der Arbeit ein und erläutert die Motivation für die Untersuchung neuer CYP2B6 Varianten.
Das Kapitel "Ergebnisse" präsentiert die Ergebnisse der in silico und in vitro Analysen. Die Arbeit beschreibt die Validierung von in silico Algorithmen zur Phänotyp Vorhersage und die Anwendung dieser Algorithmen zur Analyse neuer CYP2B6 Varianten. Anschließend wird die rekombinante Expression von nativem CYP2B6 in E. coli und die Charakterisierung der Enzymaktivität der neuen Varianten in vitro detailliert dargestellt.
Das Kapitel "Diskussion" interpretiert die Ergebnisse der Arbeit und setzt sie in den Kontext der aktuellen Forschung. Die Arbeit diskutiert die Validierung der in silico Vorhersagen, die Auswirkungen der neuen CYP2B6 Varianten auf die Enzymaktivität und die klinische Relevanz der Ergebnisse für die HIV Therapie. Die Arbeit schließt mit einem Ausblick auf zukünftige Forschungsvorhaben.
Schlüsselwörter
Pharmakogenetik, Cytochrom P450, CYP2B6, Polymorphismus, Einzelnukleotid Polymorphismus (SNP), Genotyp-Phänotyp Beziehung, in silico Vorhersage, rekombinante Expression, Bupropion, HIV Therapie, Efavirenz, Nevirapin, loss of function Phänotyp.
- Quote paper
- Robert Radloff (Author), 2011, Pharmakogenetische Analyse neuer CYP2B6 Varianten mittels rekombinanter Expression und in silico Vorhersagen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/317551
