In dieser Bachelorarbeit wurden verschiedene Genetische Marker für hämatologische Krebserkrankungen (z.B. MyD88, U2AF1, Jak2), mithilfe derer Aussagen über die Diagnose bzw. Prognose einer Krebserkrankungen machen können, eingesetzt, um die Methode der Pyrosequenzierung auf ihre Grenzen hin zu testen. Es wurden verschiedene Ansätze (Plasmide, Patienten-DNA, etc.) gewählt, bei denen Verdünnungsreihen mittels Pyrosequenzierung analysiert wurden. Somit wurde letztendlich getestet, wie wenig mutierte Allele in einer Patientenprobe vorhanden sein dürfen, damit die Methode die Mutation noch zuverlässig detektiert.
Inhaltsverzeichnis
- Zusammenfassung
- Abkürzungsverzeichnis
- Einleitung
- Anwendungen von Sequenzanalysen in der Onkologie
- Pyrosequenzierung als etablierte Methode in der Sequenzanalyse
- Im Rahmen dieser Arbeit untersuchte genetische Marker
- Zielsetzungen dieser Arbeit
- Material
- Verbrauchsmaterialien
- Zelllinien
- Patientenproben
- Primer
- Kitsysteme
- Reagenzien und Lösungen
- Geräte, Software und Datenbanken
- Methoden
- DNA-Isolierung aus FFPE-Gewebe
- DNA-Konzentrationsbestimmung
- NanoDrop 2000 Spectrophotometer
- QubitⓇ 2.0 Fluorimeter
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Quantitative real-time PCR
- Klonierung mittels TOPOⓇ TA CloningⓇ - Technologie
- Plasmidisolierung
- Pyrosequenzierung
- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
- Ergebnisse
- Verdünnungsanalysen des Gens U2AF1
- Verdünnungsanalysen des Gens MYD88
- Verdünnungsanalysen des Gens Jak2
- Diskussion
- U2AF1: Analytische Sensitivität von Codon S34 im Vergleich zu Codon Q157
- MYD88: Sensitivität niedriger als bei Codon S34 trotz Auftreten zusätzlicher Peaks
- Jak2: Anwendung einer Zelllinien-Mischungsstudie zur Evaluierung der Sensitivität des Assays
- Ausblick
- Danksagung
- Literaturverzeichnis
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Bachelorarbeit befasst sich mit der Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays in der hämatopathologischen Diagnostik. Ziel ist es, eine Anleitung zu entwickeln, die die schnelle und effiziente Erstellung von Positivkontrollen für beliebige Sequenzbereiche ermöglicht.
- Entwicklung einer Methode zur Herstellung von Positivkontrollen für Pyrosequenzierungs-Assays
- Evaluierung der analytischen Sensitivität von Pyrosequenzierungs-Assays für verschiedene genetische Marker
- Anwendung verschiedener Methoden zur Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays, wie Verdünnungsanalysen und Zelllinien-Mischungsstudien
- Bewertung der Eignung von Pyrosequenzierungs-Assays für die routinemässige Diagnostik in der Hämatopathologie
- Diskussion der Ergebnisse und möglicher zukünftiger Anwendungen der entwickelten Methode
Zusammenfassung der Kapitel
Die Arbeit beginnt mit einer Einleitung, die den Kontext der Sequenzanalysen in der Onkologie und die Bedeutung der Pyrosequenzierung als etablierte Methode in diesem Bereich beleuchtet. Sie beschreibt die genetischen Marker, die im Rahmen der Arbeit untersucht werden, und erläutert die Zielsetzungen der Arbeit. Das Kapitel "Material" stellt die verwendeten Materialien und Methoden vor, einschließlich Zelllinien, Patientenproben, Primern, Kitsystemen, Reagenzien und Geräten. Das Kapitel "Methoden" beschreibt die detaillierten Vorgehensweisen, die für die DNA-Isolierung, DNA-Konzentrationsbestimmung, PCR, quantitative real-time PCR, Klonierung, Plasmidisolierung, Pyrosequenzierung und Polyacrylamid-Gelelektrophorese angewendet wurden. Das Kapitel "Ergebnisse" präsentiert die Ergebnisse der Verdünnungsanalysen für die Gene U2AF1, MYD88 und Jak2, einschließlich der analytischen Sensitivitäten. Die Diskussion analysiert die Ergebnisse und diskutiert die Bedeutung der entwickelten Methode für die Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays in der hämatopathologischen Diagnostik. Die Arbeit schließt mit einem Ausblick auf zukünftige Anwendungen der entwickelten Methode.
Schlüsselwörter
Pyrosequenzierung, hämatopathologische Diagnostik, Validierung, Positivkontrollen, Sensitivität, Spezifität, Verdünnungsanalysen, Zelllinien-Mischungsstudien, genetische Marker, U2AF1, MYD88, Jak2, FFPE-Gewebe, quantitative real-time PCR, Klonierung, Plasmidisolierung
Häufig gestellte Fragen
Was ist Pyrosequenzierung?
Pyrosequenzierung ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die auf der Detektion von emittiertem Licht bei der Inkorporation von Nukleotiden basiert und zur Identifizierung von Mutationen genutzt wird.
Wofür werden Marker wie MyD88 oder Jak2 untersucht?
Diese genetischen Marker sind entscheidend für die Diagnose und Prognose hämatologischer Krebserkrankungen wie Leukämie oder Lymphome.
Was bedeutet analytische Sensitivität in der Diagnostik?
Sie gibt an, wie gering der Anteil mutierter Allele in einer Probe sein darf, damit die Methode die Mutation noch zuverlässig erkennt.
Wie werden Positivkontrollen für Assays erstellt?
In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um Positivkontrollen effizient mittels Klonierung in Plasmide herzustellen.
Warum ist die Validierung von Sequenzanalysen wichtig?
Nur durch eine Validierung kann sichergestellt werden, dass diagnostische Tests im klinischen Alltag präzise Ergebnisse liefern und Fehlbehandlungen vermieden werden.
- Quote paper
- Lena Thöle (Author), 2014, Quantitative Validierung von Pyrosequenzierungs-Assays für die hämatopathologische Diagnostik, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/299936
