Eingescanntes Textdokument aus dem Jahre 1990 in Chemischer Technologie mit Schwerpunkt Biotechnologie:
In dieser Arbeit wurde das Dipeptid N-Benzoxycarbonyl-alanylglycin
enzymatisch synthetisiert.
Die Esteraseaktivität von proteolytischen Enzymen wie Papain
macht die kinetisch kontrollierte Dipeptidsynthese möglich.
Zunächst wurde der Einfluß verschiedener Parameter wie
Substratstabilität, Enzym- und Substratkonzentration sowie pHWert-
Änderungen in einem pH-Stat untersucht.
Hierzu wurde ein Titrator der Firma Radiometer Copenhagen
verwendet, der das Arbeiten unter Temperatur- und pH-Konstanz
ermöglicht. Mit den hier gewonnenen Erkenntnissen wurde eine
kontinuierliche Synthese in verschiedenen Reaktoren durchgeführt.
Als Substrat wurde N-Benzoxycarbonyl-alanin-methylester
eingesetzt. Da das pH-Optimum von Papain für die Dipeptidsynthese
im alkalischen Bereich liegt, wird der eingesetzte Ester unter
diesen Bedingungen verseift.
Die unerwünschte Adsorption des Substrates an den Kunststoffoberflächen der Reaktionsgefäße und der Ultrafiltrationsmembranen erschwerte den kontinuierlichen Betrieb und die Beurteilung der Ergebnisse. Die Substratkonzentration in der Reaktionslösung wird durch die Adsorption verringert.
Der Enzym-Membran-Reaktor starter-KidTII der Firma Filtron und das
Hohlfasermodul Bioran® der Firma Schott wurden zunächst
kontinuierlich betrieben.
In diesen beiden Reaktoren wurde eine definierte Menge Enzym
vorgelegt, die durch eine Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten
wurde.
Die Retention des Enzyms wurde bei überprüft. Hierbei zeigte sich, dass aktives Enzym austrat.
Beim starter-KidTII konnte kein aktives Enzym im Filtrat
nachgewiesen werden, die Enzym-Retention war hier vollständig.
Ein anderes Problem ergab sich aus der beobachteten
Druckbelastung der Membran mit zunehmender Enzymkonzentration.
Dies läßt auf eine Deckschichtbildung von Enzym schließen.
Um die Probleme, die bei der homogenen Enzymkatalyse auftraten,
zu umgehen, wurde das Enzym an eine Affinitätsmembran Immobilon~
der Firma Millipore kovalent gebunden. Die so erhaltene Membran
mit fixiertem Enzym wurde in den Flachbettreaktor der Firma
Bioengeneering eingesetzt.
Durch diese Fixierung des Enzyms wird die Deckschichtbildung
vermieden und die Enzymstabilität erhöht.
[...]
Aus den erhaltenen Analysendaten waren Rückschlüsse auf Umsatz
des Substrates und Selektivität bei der Dipeptidsynthese möglich.
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung
2 Einleitung
2.1 Bedeutung von kurzkettigen Peptiden
2.2 Problemstellung
3 Theoretischer Teil
3.1 Kinetisch kontrollierte Dipeptidsynthese
3.1.1 Papain als proteolytisches Enzym
3.1.2 Kinetische Kontrolle
3.2 Immobilisierung
3.3 Mathematische Modelle
3.3.1 Wichtige Beziehungen
3.3.2 Reaktoren
3.3.2.1 Materialbilanz
3.3.2.2 Kontinuierlicher Rührkessel
3.3.2.3 Kontinuierliches Strömungsrohr
3.3.2.4 Enzym-Membran-Reaktor
3.3.3 Stofftransportlimitierung
3.3.4 Ultrafiltrationsmembranen
3.3.4.1 Durchsatz
3.3.4.2 Sterische Rückhaltung
4 Praktischer Teil
4.1 Batch-Versuche im pH-Stat
4.1.1 Prinzip und Aufbau
4.1.2 Optimierung der Reglereinstellung
4.1.3 Bilanzierung
4.1.3.1 Verdünnung durch Titrant
4.1.3.2 Berücksichtigung der Probenahme
4.1.3.3 Fehlerabschätzung
4.1.3.4 Berechnung der Stoffmenge
4.1.4 Durchführung der Batch-Versuche
4.1.5 Substratstabilität
4.1.5.1 Verseifung von Z-Ala-OMe bei pH 9.2 . .
4.1.5.2 Inkubation von Z-Ala-OMe bei pH 6.0..
4.1.6 Einfluß der Enzymkonzentration
4.1.7 Dipeptidsynthese Versuch A
4.1.8 Dipeptidsynthese Versuch В
4.1.9 Prüfung auf Produkthemmung
4.1.10 Produkt stabili tat bei pH-Abfall
4.2 Immobilisierung durch Enzymeinschluß
4.2.1 Enzym-Membran-Reaktor: Starter-Kid™
4.2.1.1 Technische Daten
4.2.1.2 Dipeptidsynthese Versuch C
4.2.1.3 Dipeptidsynthese Versuch D
4.2.1.4 Druckverlust
4.2.1.5 Enzymverteilung und Retention
4.2.2 Hohlfasermodul: Bioran™
4.2.2.1 Technische Daten
4.2.2.2 Möglicher Betrieb mit Rückführung
4.2.2.3 Betrieb als Diffusionsreaktor
4.2.2.4 Dipeptidsynthese Versuch E
4.2.2.5 Retention von Papain
4.3 Immobilisierung durch Membranfixierung an Immobilon™, und Anwendung im Flachbettreaktor
4.3.1 Technische Daten Immobilon™
4.3.2 Methode der Immobilisierung
4.3.2.1 Verwendete Puffer
4.3.2.2 Durchführung
4.4 Analytik der Reaktionsgemische
4.4.1 Rever sed-Phase-Chromatographie
4.4.2 Chromatographische Bedingungen
4.4.3 Konzentrationsbestimmung
4.4.4 Fehlerbetrachtung
5 Ergebnisse
5.1 Schlußfolgerungen aus Batch-Versuchen
5.2 Vergleich der erreichten Selektivitäten
5.3 Raum-Zeit-Ausbeuten
5.3.1 Grundlegende Schlußfolgerungen
5.3.2 Vergleich der Reaktoren
5.3.2.1 Starter-Kid™
5.3.2.2 Bioran®
5.3.2.3 Flachbettreaktor mit Immobilon
5.3.3 Substratadsorption
6 Diskussion und Ausblick
7 Literaturverzeichnis
1 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde das Dipeptid N-Benzoxycarbonyl-alanyl- glycin enzymatisch synthetisiert.
Die Esteraseaktivität von proteolytischen Enzymen wie Papain macht die kinetisch kontrollierte Dipeptidsynthese möglich.
Zunächst wurde der Einfluß verschiedener Parameter wie Substratstabilität, Enzym- und Substratkonzentration sowie pH- Wert-Änderungen in einem pH-Stat untersucht.
Hierzu wurde ein Titrator der Firma Radiometer Copenhagen verwendet, der das Arbeiten unter Temperatur- und pH-Konstanz ermöglicht. Mit den hier gewonnenen Erkenntnissen wurde eine kontinuierliche Synthese in verschiedenen Reaktoren durchgeführt.
Als Substrat wurde N-Benzoxycarbonyl-alanin-methylester eingesetzt. Da das pH-Optimum von Papain für die Dipeptidsynthese im alkalischen Bereich liegt, wird der eingesetzte Ester unter diesen Bedingungen verseift.
Die unerwünschte Adsorption des Substrates an den Kunststoffoberflächen der Reaktionsgefäße und der Ultrafiltrationsmembranen erschwerte den kontinuierlichen Betrieb und die Beurteilung der Ergebnisse. Die Substratkonzentration in der Reaktionslösung wird durch die Adsorption verringert.
Der Enzym-Membran-Reaktor Starter-Kid™ der Firma Filtron und das Hohlfasermodul Bioran® der Firma Schott wurden zunächst kontinuierlich betrieben.
In diesen beiden Reaktoren wurde eine definierte Menge Enzym vorgelegt, die durch eine Ultrafiltrationsmembran zurückgehalten wurde.
Die Retention des Enzyms wurde bei den oben genannten Reaktoren überprüft. Hierbei zeigte sich, daß aus dem Hohlfasermodul aktives Enzym austrat.
Beim Starter-Kid™ konnte kein aktives Enzym im Filtrat nachgewiesen werden, die Enzym-Retention war hier vollständig. Ein anderes Problem ergab sich aus der beobachteten Druckbelastung der Membran mit zunehmender Enzymkonzentration. Dies läßt auf eine Deckschichtbildung von Enzym schließen.
Um die Probleme, die bei der homogenen Enzymkatalyse auftraten, zu umgehen, wurde das Enzym an eine Affinitätsmembran limnobiIon™ der Firma Millipore kovalent gebunden. Die so erhaltene Membran mit fixiertem Enzym wurde in den Flachbettreaktor der Firma Bioengeneering eingesetzt.
Durch diese Fixierung des Enzyms wird die Deckschichtbildung vermieden und die Enzymstabilität erhöht.
Die Analytik der Reaktionsgemische erfolgte mittels HPLC, wobei das Edukt N-Benzoxycarbonyl-alanin-methylester (Z-Ala-OMe), das Dipeptid N-Benzoxycarbonyl-alanylglycin (Z-Ala-Gly) und das Hydrolyseprodukt N-Benzoxycarbonyl-alanin (Z-Ala-OH) quantitativ bestimmt wurden.
Aus den erhaltenen Analysendaten waren Rückschlüsse auf Umsatz des Substrates und Selektivität bei der Dipeptidsynthese möglich.
2 Einleitung
2.1 Bedeutung von kurzkettigen Peptiden1
Aminosäure- bzw. Peptid-Präparate werden als "maßgeschneiderte" Aminosäurelösungen in der parenteralen Ernährung eingesetzt. Diese kurzkettigen Peptide werden nach venöser Injektion schnell aufgenommen, und die nach Hydrolyse freigesetzen Aminosäuren stehen für die Proteinbiosynthese zur Verfügung.
Voraussetzung für die industrielle Produktion ist jedoch die Bereitstellung von synthetischen Peptiden in ausreichenden Mengen und zu vernünftigen Preisen.
Bisher wurden verschiedene Dipeptide nach der N-Carboxy-Anhydrid- Methode auf chemischem Weg synthetisiert.
Biotechnologisch wurden zur Dipeptidsynthese Proteasen pflanzlichen, tierischen und mikrobiellen Ursprungs eingesetzt.
Gegenüber der chemischen Synthese zeichnet sich die enzymkatalysierte Peptidsythese durch folgende Vorteile aus:
- stereospezifischer Reaktionsverlauf
- kurze Reaktionszeiten, da weniger Reaktionsschritte
- vereinfachte Reinigungsprozedur
Die effektivste Form der Wiederverwendung des wertvollen Enzyms besteht in einem ununterbrochen Einsatz in einem kontinuierlichen betriebenen Reaktor.
2.2 Problemstellung
In der Diplomarbeit von Frau Kühlmann2 konnte gezeigt werden, daß die kontinuierliche Dipeptidsynthese im Flachbettreaktor von Z-Ala-Gly prinzipiell möglich ist.
Hierbei wurde gelöstes Enzym durch eine Ultrafiltrationsmembran im kontinuierlich betriebenen Flachbettreaktor zurückgehalten.
Allerdings wurde ein exponentieller Abfall der Raum-Zeit-Ausbeute im kontinuierlichem Betrieb beobachtet. Durch Nachdosierung von frischem Enzym in den Reaktor wurde dieser Abfall kompensiert. Es war deshalb zu prüfen, ob das Enzym aus dem Reaktor ausgespült wurde.
Bei einer Immobilisierung durch Trägerfixierung kann kein frischer Katalysator in den kontinuierlichen Prozeß eingebracht werden. Jedoch wird möglicherweise der extreme Aktivitätsverlust des nativen Enzym durch die Trägerfixierung minimiert.
Wie Frau Kühlmann2 zeigte, lag die Selektivität bei kontinuierlicher Prozeßführung weit unter der erreichten Selektivität in Batch-Versuchen.
Deshalb war eine Optimierung der Prozeßbedingungen sowie eine grundlegende Untersuchung der auftretenden Probleme bei der kontinuierlichen Prozeßführung notwendig.
Zu dieser Optimierung sollte ein Titrator der Firma Radiometer Copenhagen eingesetzt werden, weil dieser das Arbeiten unter konstanten Reaktionsbedingungen ermöglicht.
Mit den optimierten Bedingungen sollten verschiedene Reaktortypen auf ihre Eignung für die Dipeptidsynthese mit Papain untersucht werden.
Die experimentell gefunden Daten sollten mit den Aussagen mathematischer Modelle aus der Literatur verglichen werden.
3 Theoretischer Teil
3.1 Kinetisch kontrollierte Dipeptidsynthese
3.1.1 Papain als proteolytisches Enzym
Proteasen weisen neben Peptidase- auch Esterase-Aktivität auf3.
Die Peptidase-Aktivität ist bei pH-Werten > 8 nicht nachzuweisen, während die Esterase-Aktivität des Papains dominiert.4,5
Man setzt N-geschütze Aminosäureester als Carbonylkomponenten ein.
Diese Carbonylkomponente stellt ein erstes Substrat für das Enzym dar.
Man stellte fest, daß mit Benzoxycarbonyl-Schutzgruppe (Z-) als unpolarem Rest die besten Ausbeuten bei der enzymatischen Dipeptidsynthese mit Papain zu erzielen sind.6
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.1 Mehrsubstratkinetik bei enzymatischer Dipetidsynthese, modifiziert nach Kullmann7
Zwei Substrate binden abhängig voneinander an das Enzym. In einem ersten Schritt bindet A (Z-Ala-OMe), in einem zweiten Schritt das Substrat В (Glycin). Wird die Konzentration von В konstant gehalten, so tritt eine sigmoide Sättigungsfunktion auf.8
Es handelt sich hierbei um eine Kooperativität von zwei verschiedenen Substratmolekülen.
3.1.2 Kinetische Kontrolle
Das Enzym Papain katalysiert die Folgereaktion, wobei im zweiten Schritt eine Parallelreaktion stattfindet.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.2 Energetische Verhältnisse
Der erste Schritt, die Reaktion mit der Carbonylkomponente zum Enzym-Acyl-Komplex, verläuft schnell. Dieser Enzym-Acyl-Komplex ist deshalb isolierbar.
Der zweite Schritt besteht aus einer Parallelreaktion, in der zwei verschiedene Nucleophile an den Enzym-Acyl-Komplex angreifen können.
Wie Abb.3.2 verdeutlicht, ist das Hydrolyseprodukt thermodynamisch stabiler, es weist einen kleineren (negativen) Wert der freien Enthalpie (AG) auf.
Die Aktivierungsenergie zur Bildung des Dipeptids ist kleiner als die zur Bildung des Hydrolyseprodukts.
Die kinetische Kontrolle ist bestätigt, wenn Peptidase-Aktivität nicht nachweisbar ist, d.h. keine Rückreaktion erfolgt (k_2 = 0).
Eine Verringerung der Glycinkonzentration hat eine Verkleinerung des Verhältnisses k2/k3 zur Folge. Wasser greift vermehrt als Nucleophil an, es wird mehr Hydrolyseprodukt gebildet.
3.2 Inunobi 1 isierung
Allgemein nimmt ein Katalysator an einer chemischen Reaktion teil und liegt vor und nach der Reaktion im gleichen Zustand vor.
Wenn es nun gelingt, den Katalysator in einem System zurückzuhalten, kann kontinuierlich produziert werden. Durch die Produktionsleistung ist auch die Katalysatormenge bzw. das Reaktorvolumen vorgegeben.
Erschwerend kommt bei biologischen Materialien hinzu, daß sie nur innerhalb bestimmter Milieubedingungen ihre biologische Aktivität behalten.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.3 Verfahrensweisen mit isolierten Enzymen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.4 Möglichkeiten der Anordnung des Biokatalysators S: Substrat, P: Produkt, E: Enzym9 a - c : Fixierung von Enzym an Trägermaterial d,e : Einschluß von nativem Enzym
Die in dieser Arbeit eingesetzten Reaktoren:
d: Hohlfasermodul als Diffusionsreaktor: Bioran®
e: Membranreaktor : Starter-Kid™
b: Flachbett-Membranreaktor mit Immobilon™-Affinitätsmembran
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Tab.3.1 Gegenüberstellung von trägerfixiertem und nativem Enzym
3.3 Mathematische Modelle
3.3.1 Wichtige Beziehungen
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Durch Messung des Volumenstromes und der Konzentration des Produktes am Reaktorausgang kann die Raum-Zeit-Ausbeute berechnet werden.
3.3.2 Reaktoren
3.3.2.1 Materialbilanz
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.5 Materialbilanz im Reaktor
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Die Komponente i kann sowohl Produkt als auch Edukt sein. Wird auf ein Edukt bezogen, so wird die Stoffmengenänderung negativ, denn die Stoffmenge wird mit steigendem Umsatz abnehmen.
Definition der Reaktionsgeschwindigkeit
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Wenn das Reaktionsvolumen konstant ist, so gilt
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Umrechnung der stoffbezogenen in eine Äquivalenz Reaktionsgeschwindigkeit
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Im stationären Zustand ist die zeitliche Änderung der Molzahl im Reaktor gleich Null.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Damit wird aus Gl.3.16 für ein Edukt А
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
3.3.2.2. Kontinuierlicher Ruhrkessel
Abb.3.6 Materialbilanz im idealen kontinuierlichen Rührkessel
Bei einem idealen Rührkessel liegt am Reaktorausgang und im Reaktor die gleiche mittlere Substratkonzentration vor.(vergi. Abb.3.6)
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Aus Gl.3.19 erhält man für eine Reaktion 1. Ordnung durch Separation der Variablen, Integration und Einführung des Umsatzes: tb : Backmix-Zeit
Der ideale Rührkessel ist homogen und stationär. In ihm stellt sich eine mittlere Substratkonzentration ein.
Da die Substratkonzentration konstant bleibt, ist auch die Reaktionsgeschwindigkeit konstant.
In einem Reaktor mit vollständiger Rückvermischung laufen Parallel- und Folgereaktionen bevorzugt ab.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.7 Bilanz im kontinuierlichen Strömungsrohr
Die Konzentration des Edukts A ist hier eine Funktion der Ortskoordinate. Die Konzentration des Eduktes nimmt entlang der Ortskoordinate ab.
Aus Gl. 3.19 erhält man für eine Reaktion 1. Ordnung durch Separation der Variablen und Integration unter Einführung des Umsatzes:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Im Gegensatz zum kontinuierlichen Rührkessel ist hier die Reaktionsgeschwindigkeit keine Konstante. Das Strömungsrohr ist stationär und inhomogen.
Im Strömungsrohr ist deshalb bei gegebenem Reaktorvolumen ein höherer Umsatz möglich als im idealen Rührkessel.
Durch die fehlende Rückvermischung werden Folgereaktionen vermieden.
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Abb.3.8: Vergleich des Umsatzes zwischen zwei kontinuierlichen Reaktoren (k2 = 0.12 min-1)
a) totale RV : totale Rückvermischung nach Gl.3.20 im kontinuierlichem Rührkessel
b) ohne RV : ohne Rückvermischung nach Gl.3.21 im kontinuierlichem Strömungsrohr
Wie aus Abb.3.8 hervorgeht, ist für einen bestimmten Umsatz bei einem kontinuierlichen Rührkessel eine beträchtlich höhere Verweilzeit notwendig als in einem Strömungsrohr.
3.3.2.4 Der Enzym-Membran-Reaktor
Nach Noworyta et al.10 kann ein Enzym-Membran-Reaktor mit seitlichem Ein- und Ausgang in 5 verschiedene Reaktionszonen eingeteilt werden.
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Abb.3.9 Ultrafiltrationsprozeß
1. Das Reservoir stellt einen Rührkessel dar, hier befinden sich die Sensoren.
2. Schläuche vom Reservoir zum UF-Modul : Strömungsrohr
3. Raum zwischen Druckseite und Ultrafiltrationsmembran: Strömungsrohr mit seitlichem Ausgang. Durch den seitlichen Ausgang entweicht das Permeat.
4. Schläuche vom UF-Modul zum Reservoir: Strömungsrohr
5. Konzentrationspolarisation auf UF-Membran : Festbettreaktor
Diese Einteilung macht eine Auslegung des Reaktors möglich.
Allerdings benötigt man hierfür die Kinetik der enzymatischen Reaktion.
Die Reaktionsgeschwindigkeit ist eine Funktion der Substratkonzentration. Unterstellt man die Gültigkeit einer Michaelis-Menten-Kinetik, dann folgt:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Abhängigkeit gilt allerdings nur für eine konstante Enzymkonzentration. Da jedoch in der Praxis das Enzym inaktiviert wird bzw. aus dem Reaktor ausgespült wird, muß dieser Aktivitätsverlust berücksichtigt werden.
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Da ein Teil des eingesetzten Enzyms eine Deckschicht auf der Membran bildet, ist die Konzentration in der Lösung geringer.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Für die exakte mathematische Ableitung sei auf10 verwiesen.
Durch die kovalente Bindung des Enzym an die Immobilon™- Affinitätsmembran erhält man Festbett-Charakter. Hierdurch wird u.a. die Deckschichtbildung vermieden.
3.3.3 Stofftransportlimitierung
Die apparente Kinetik ist die Summe von Stofftransport ( Makrokinetik ) und Reaktion am Enzym ( Mikrokinetik ).
Der Stofftransport kann die Kinetik des Enzyms nur beeinflussen, wenn die Geschwindigkeit des Stof f transports geringer ist als die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms.11
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.10 Substratkinetik eines Enzyms mit Michaelis-Menten- Kinetik und eines diffusionsgehemmten Enzyms.12
Das Enzymmolekül ist im Vergleich zum Substrat sehr groß und reagiert mit den Substraten nur am ВindungsZentrum. Zum anderen muß ein erstes angekoppeltes Substrat eine bestimmte Zeit an seinem Bindungszentrum verweilen, bis der zweite Reaktand eingefangen wird.13
3.3.4 Ultrafiltrationsmembranen
3.3.4.1 Durchsatz
Die Begrenzung des Durchsatzes kommt dadurch zustande, daß ein maximaler Betriebsdruck nicht überschritten werden darf.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die spezifische Membranfläche ist gegeben durch:
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Die Firma Filtron bietet vier verschiedene Typen von Ultrafiltrationsmembranen an.
In dieser Arbeit wurden OMEGACELL™-Membranen (erkennbar an der weißen Volumenskala) verwendet. Dieser Typ zeichnet sich durch seine geringe Proteinadsorption bei gleichzeitiger Lösungsmittelbeständigkeit aus.
Herstellerangaben: Maximaler Flux durch eine 10 000 Dalton
Membran (bei Maximaldruck und 25 °C)
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Wie aus Gl.3.25 hervorgeht, erlauben Reaktoren mit größerer spezifischer Filtrationsfläche einen größeren Durchsatz.
3.3.4.2 Sterische Rückhaltung von Makromolekülen
Da es technisch nicht möglich ist, Membranen mit exakt einheitlichem Porendurchmesser herzustellen, haben Membranen nie eine 100 %ige Retention.
Die Makromoleküle werden dadurch teilweise ausgewaschen.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Abb.3.11 Retention verschiedener Ultrafiltrationsmembranen.
Aus Firmenschrift Filtron16
Papain besitzt ein Molekulargewicht von 21 000 g/mol. Mit der verwendeten Membran (Cut-off von 10 000 Dalton) liegt man, wie aus Abb.3.11 ersichtlich, bei einer Retention größer 90 %.
Der Verlust an Enzym durch Auswaschung wird u.a. von einer Inaktivierung des Enzyms durch Scherstreß begleitet. Dieser Scherstreß wird durch das Rühren erzeugt.
Das Rühren ist jedoch notwendig, um einen ausreichenden Stofftransport aufrechtzuerhalten bzw. um die auftretende Deckschichtbildung zu minimieren.14
4 Praktischer Teil
4.1 Batch-Versuche im pH-Stat 4.1.1. Prinzip und Aufbau
Bei enzymatischen Reaktionen ist das Arbeiten unter pH- und Temperaturkonstanz von entscheidender Bedeutung.
Im vorliegendem Fall der enzymatischen Dipeptidsynthese fällt der pH-Wert mit zunehmendem Umsatz des Substrates. Dadurch bewegt man sich aus dem pH-Optimum des Enzyms.
Die Affinität vom Enzym zum Substrat sinkt. Durch Parallelreaktionen sinkt die Selektivität.
Mit Hilfe des pH-Stat wird der pH-Wert durch Zudosieren von Natronlauge konstant gehalten.
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
Häufig gestellte Fragen
Was ist das Hauptziel dieser Arbeit?
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die enzymatische Synthese des Dipeptids N-Benzoxycarbonyl-alanyl-glycin.
Wie wird die Dipeptidsynthese in dieser Arbeit durchgeführt?
Die Dipeptidsynthese wird durch die Nutzung der Esteraseaktivität von proteolytischen Enzymen wie Papain in einer kinetisch kontrollierten Reaktion durchgeführt.
Welche Parameter wurden in den Batch-Versuchen untersucht?
In den Batch-Versuchen wurden verschiedene Parameter untersucht, darunter die Substratstabilität, die Enzym- und Substratkonzentration sowie pH-Wert-Änderungen.
Welche Reaktoren wurden für die kontinuierliche Synthese verwendet?
Für die kontinuierliche Synthese wurden verschiedene Reaktoren verwendet, darunter der Enzym-Membran-Reaktor Starter-Kid™, das Hohlfasermodul Bioran® und ein Flachbettreaktor mit Immobilon™.
Welches Substrat wurde verwendet und welche Probleme traten auf?
Als Substrat wurde N-Benzoxycarbonyl-alanin-methylester (Z-Ala-OMe) eingesetzt. Ein Problem war die Verseifung des Esters im alkalischen pH-Bereich sowie die Adsorption des Substrates an Kunststoffoberflächen und Ultrafiltrationsmembranen.
Was wurde mit den Reaktionsgemischen analysiert?
Die Reaktionsgemische wurden mittels HPLC analysiert, wobei Edukt (Z-Ala-OMe), Dipeptid (Z-Ala-Gly) und Hydrolyseprodukt (Z-Ala-OH) quantitativ bestimmt wurden.
Welche Schlüsse konnten aus den Analysendaten gezogen werden?
Aus den Analysendaten konnten Rückschlüsse auf den Umsatz des Substrates und die Selektivität bei der Dipeptidsynthese gezogen werden.
Was sind die Vorteile der enzymkatalysierten Peptidsynthese gegenüber der chemischen Synthese?
Die enzymkatalysierte Peptidsynthese zeichnet sich durch stereospezifischen Reaktionsverlauf, kurze Reaktionszeiten (weniger Reaktionsschritte) und vereinfachte Reinigungsprozeduren aus.
Warum ist die Immobilisierung von Enzymen wichtig?
Die Immobilisierung von Enzymen ermöglicht einen kontinuierlichen Einsatz in einem Reaktor, was die Wiederverwendung des Enzyms und somit die Wirtschaftlichkeit des Prozesses verbessert.
Welche mathematischen Modelle werden verwendet?
Mathematische Modelle werden verwendet, um das Verhalten der Reaktoren zu beschreiben und die experimentellen Daten mit theoretischen Vorhersagen zu vergleichen.
Welche Typen von Ultrafiltrationsmembranen werden verwendet?
OMEGACELL™-Membranen der Firma Filtron werden verwendet. Dieser Typ zeichnet sich durch seine geringe Proteinadsorption bei gleichzeitiger Lösungsmittelbeständigkeit aus.
Warum werden Batch-Versuche im pH-Stat durchgeführt?
Batch-Versuche im pH-Stat werden durchgeführt, um unter pH- und Temperaturkonstanz zu arbeiten, was für enzymatische Reaktionen von entscheidender Bedeutung ist.
- Quote paper
- Dr. Bert Gabler (Author), 1990, Kontinuierliche Dipeptidsynthese in verschiedenen Reaktoren, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/171512
