Seit der Entdeckung der modernen Genetik war es immer ein Traum der Forscher, bestimmte Gene spezifisch und ohne Nebenwirkungen beeinflussen zu können, ein Traum der nach der Entzifferung des menschlichen Genoms und der Entdeckung der darin vorhandenen Onkogene nichts an Aktualität verloren hat. In der heutigen Zeit, in der viele Erkrankungen wie Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen oder Demenz noch immer oft nur unzureichend behandelt werden können, und verschiedene Infektionskrankheiten sogar wieder auf dem Vormarsch sind, ist es wichtiger als jemals zuvor komplett neuartige Therapeutika zu finden. Heutige Medikamente wirken in aller Regel, indem sie in den Stoffwechsel oder in Signalsysteme des Körpers eingreifen und damit Vorgänge auf der Ebene der Proteine oder Rezeptoren beeinflussen. Damit lässt sich zwar schon eine weite Reihe von Effekten erzielen, aber die grundlegende genetische Steuereinheit der Zelle, die Nukleinsäuren im Zellkern, bleiben weitgehend unangetastet. Dabei ließe sich gerade hier, aufgrund dieser Steuerrolle, die größte Vielfalt an möglichen Effekten erzielen. Eine komplett neue Klasse von Therapeutika könnte sich diese Rolle zu Nutze machen, um ganz neue und effektivere Arten der Krankheitsbekämpfung zu erschließen. Dabei besäßen sie gleichzeitig den Vorteil, dass sie sich mit nur wenigen Modifikationen am grundlegenden System gegen viele verschiedene Krankheiten einsetzen ließen und man nicht für jede Krankheit ein völlig neues Arzneimittel entwickeln müsste.
Den Durchbruch erlebt momentan ein neuer Ansatz, die so genannte RNA-Interferenz mithilfe von „short-interfering-RNAs (siRNAs). Dabei ist es möglich, durch Applikation von kurzer, doppelsträngiger RNA gezielt die aus dem Zellkern kommende messenger RNA (mRNA) in der Zelle zu zerstören. Damit kann die Transkription aus dem Genom zum jeweiligen Protein gezielt unterbrochen, und so Einfluss auf die Konzentration bestimmter Proteine genommen werden.
In der folgenden Arbeit will ich unter Einbeziehung eigener Ergebnisse einen kurzen Überblick über diesen Mechanismus geben und das Potenzial diskutieren, das bei der Bekämpfung von verschiedenen Krankheiten dahinter zu sehen sein könnte. Dabei möchte ich auch auf Probleme eingehen, die einem breiten Einsatz im Moment noch im Wege stehen, und mögliche, derzeit diskutierte Lösungsvorschläge aufzeigen.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 RNA-Interferenz in der Zelle
2.1 Die Entdeckung der RNA-Interferenz
2.2 Die Rolle der RNA-Interferenz in der Zelle
2.3 Mechanismus der RNA-Interferenz
2.3.1 Dicer und die Spaltung von dsRNA in siRNAs
2.3.2 RISC und PTGS
2.3.3 RITS und TGS
2.3.4 miRNAs als natürliche Auslöser von RNA-Interferenz
2.4 Kriterien für effiziente siRNAs
3 Versuch zur Stummschaltung von ROCK-1 in humanen Nierenzellen
3.1 Übersicht über Rho-Kinase
3.2 Methoden
3.3 Ergebnisse
3.4 Diskussion der Ergebnisse
4 Diskussion des potentiellen Nutzens von siRNA bei der Behandlung von Krankheiten
4.1 Vorteile von Medikamenten auf siRNA-Basis
4.2 Probleme und ihre Lösungsansätze bei der Entwicklung von Medikamenten auf siRNA-Basis
4.2.1 Die Frage des Einschleusens
4.2.2 Das Problem der intrazellulären Immunantwort
4.3 Aktueller Stand der Entwicklungen von Medikamenten auf siRNA-Basis
4.4 Die Frage der Sicherheit
4.5 Die Zukunft der RNA-Interferenz
5 Zusammenfassung
6 Schlussgedanken
7 Danksagungen
8 Literaturverzeichnis
9 Anhang
9.1 Übersicht über die verwendeten Begriffe
9.2 Übersicht über das Praktikum
9.3 Erläuterungen der verwendeten Chemikalien
„Zuerst ein paar Anmerkungen. Erstens, die ganze Geschichte des Gene-Stummschaltens zu erzählen wäre eine Mammutaufgabe, für die man viele Jahre schreiben müsste und die Sie nächtelang aufbleiben lassen würde. Deswegen werde ich die Geschichte mehr als ein bisschen abkürzen. Zweitens sind wir, wie Sie sehen werden, erst in der Dämmerung unseres Wissens. Sehen Sie deswegen das Folgende bitte als vorläufig an, das Beste, was wir bis hierhin schaffen konnten“
Andrew Z. Fire, Nobelpreisträger für Physiologie und Medizin 2006 in seiner Rede vor dem Nobelpreiskomitee[1]
1. Einleitung
Seit der Entdeckung der modernen Genetik war es immer ein Traum der Forscher, bestimmte Gene spezifisch und ohne Nebenwirkungen beeinflussen zu können, ein Traum der nach der Entzifferung des menschlichen Genoms und der Entdeckung der darin vorhandenen Onkogene nichts an Aktualität verloren hat. In der heutigen Zeit, in der viele Erkrankungen wie Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen oder Demenz noch immer oft nur unzureichend behandelt werden können, und verschiedene Infektionskrankheiten sogar wieder auf dem Vormarsch sind,[2] ist es wichtiger als jemals zuvor komplett neuartige Therapeutika zu finden. Heutige Medikamente wirken in aller Regel, indem sie in den Stoffwechsel oder in Signalsysteme des Körpers eingreifen und damit Vorgänge auf der Ebene der Proteine oder Rezeptoren beeinflussen.[3] Damit lässt sich zwar schon eine weite Reihe von Effekten erzielen, aber die grundlegende genetische Steuereinheit der Zelle, die Nukleinsäuren im Zellkern, bleiben weitgehend unangetastet. Dabei ließe sich gerade hier, aufgrund dieser Steuerrolle, die größte Vielfalt an möglichen Effekten erzielen. Eine komplett neue Klasse von Therapeutika könnte sich diese Rolle zu Nutze machen, um ganz neue und effektivere Arten der Krankheitsbekämpfung zu erschließen. Dabei besäßen sie gleichzeitig den Vorteil, dass sie sich mit nur wenigen Modifikationen am grundlegenden System gegen viele verschiedene Krankheiten einsetzen ließen und man nicht für jede Krankheit ein völlig neues Arzneimittel entwickeln müsste.[3]
Als Hoffnungsträger hierfür galt lange die Gentherapie, bei der durch Viren fremde Gene ins Wirtsgenom übertragen werden und dort Krankheiten heilen, indem sie neue Gene einführen oder die Expression von bereits vorhandenen verändern. Aufgrund von vielen Problemen, die von unerwarteten Immunantworten bis hin zur Aktivierung von krebsauslösenden Genen, so genannten Onkogenen, durch unkontrollierte Integration in das Wirtsgenom reichen[4], konnte dieser Therapieansatz allerdings die in ihn gesteckten Erwartungen bisher noch nicht erfüllen. Von daher wird er wohl noch auf absehbare Zeit lediglich Zukunftsmusik bleiben.
Den Durchbruch erlebt momentan ein anderer Ansatz, für dessen Entdeckung im Jahr 2006 Craig Mellow und Andrew Z. Fire den Nobelpreis erhielten[5], die so genannte RNA-Interferenz mithilfe von „short-interfering-RNAs (siRNAs). Dabei ist es möglich, durch Applikation von kurzer, doppelsträngiger RNA gezielt die aus dem Zellkern kommende messenger RNA (mRNA) in der Zelle zu zerstören. Damit kann die Transkription aus dem Genom zum jeweiligen Protein gezielt unterbrochen, und so Einfluss auf die Konzentration bestimmter Proteine genommen werden. Im Gegensatz zur klassischen Gentherapie bietet dieses Verfahren viele Vorteile. So ist zum Beispiel keine nicht mehr rückgängig machbare Integration verabreichter DNA ins eigentliche Genom notwendig, wodurch man ungewollte Nebenwirkungen, wie zum Beispiel Leukämie,[3,4] vermeidet. Diese mögliche Anwendung der RNA-Interferenz zur Krankheitsbekämpfung wurde zuerst an mit Hepatitis infizierten Mäusen nachgewiesen. So schützte die Zugabe einer bestimmten siRNA diese Mäuse gegen Leber-Fibrose, eine Folgeerscheinung der Hepatitis.[6] Schon 2004, nur 6 Jahre nach der Entdeckung der RNA-Interferenz begannen die ersten klinischen Tests für ein Medikament auf siRNA-Basis. Mittlerweile werden schon verschiedene weitere Medikamente gegen eine Reihe von Krankheiten, die von Atemwegserkrankungen bis AIDS reichen, auf siRNA-Basis entwickelt, wobei das eigentliche Potenzial nach wie vor nicht ausgeschöpft ist.[7]
Aber wird die RNA-Interferenz tatsächlich eine Revolution in der Krankheitsbekämpfung einläuten oder wird sie, ähnlich wie die Gentherapie in ihren Kinderschuhen stecken bleiben?
In der folgenden Facharbeit will ich unter Einbeziehung eigener Ergebnisse erläutern, wie die RNA-Interferenz funktioniert und diskutieren was für ein Potenzial bei der Bekämpfung von verschiedenen Krankheiten in ihr zu sehen sein könnte. Dabei möchte ich zuerst auf den grundlegenden Mechanismus und danach auch auf Probleme eingehen, die einem breiten Einsatz nach wie vor im Wege stehen, und mögliche, derzeit diskutierte Lösungsvorschläge aufzeigen.
2 RNA-Interferenz in der Zelle
2.1 Die Entdeckung der RNA-Interferenz
Die RNA-Interferenz wurde als erstes in Pflanzen entdeckt, denen man zusätzliche mRNA Kopien für einen Blütenfarbstoff einbrachte. Anstatt dadurch aber noch mehr Farbstoff zu bilden und sich noch mehr zu färben, bleichten die behandelten Pflanzen aus, ein Phänomen das sich damals niemand erklären konnte[5]. Später stießen Wissenschaftler um Craig Mellow und Andrew Z. Fire bei Versuchen mit Fadenwürmern auf ein ähnliches Phänomen. Die beiden experimentierten mit so genannter antisense-RNA, mit der sie spezifische Gene ausschalten konnten. Allerdings zeigten auch Würmer, die als Kontrolle mit zusätzlichen mRNA-Kopien (sense-RNA) behandelt worden waren, dieselben Reaktionen. Fire und Mellow postulierten daraufhin, dass weder die sense- noch die antisense-RNA für das Ausschalten der Gene und damit für die Reaktion der Würmer verantwortlich war, sondern eine dritte Form von RNA, die bei beiden als Verunreinigung vorkam, nämlich doppelsträngige RNA (dsRNA). In einer Reihe von bahnbrechenden Versuchen konnten sie diese Vermutung beweisen und gleichzeitig ein Modell für den dahinter stehenden Mechanismus aufstellen.[1,5] So stellt dieses „Genstummschalten“ letztlich eine enzymatische Reaktion auf doppelsträngige RNA dar. Den zugrunde liegenden Mechanismus tauften die beiden „RNA-Interferenz“. In der Folge konnte diese auch bei vielen anderen Eukaryoten wie Pflanzen, Pilzen und Einzellern nachgewiesen werden.[7] Die weitere Aufklärung der Wirkungsweise erlaubte es dann Forschern um den Deutschen Thomas Tuschl, dieses Phänomen auch bei Säugetieren nachzuweisen.[11] Tatsächlich gibt es nur wenige Eukaryoten, denen die typischen Enzyme für eine RNA-Interferenz Antwort auf dsRNA fehlen.[5]
2.2 Die Rolle der RNA-Interferenz in der Zelle
Die weite Verbreitung der RNA-Interferenz, und die Tatsache dass Knock-out-Mutationen, die die verantwortlichen Enzyme deaktivieren, oft letal sind, lassen darauf schließen, dass die RNA-Interferenz eine wichtige Rolle bei für die Zelle überlebenswichtigen Prozessen spielt. Ursprünglich wurde in ihr eine urtümliche, aber effiziente Strategie zur Bekämpfung von Viren gesehen, von denen die meisten während ihres Lebenszyklus in einer Form mit doppelsträngiger RNA vorliegen. RNA-Interferenz kann dann dafür sorgen, dass die viralen Gene nicht mehr abgelesen werden und das Virus sich nicht mehr vermehren kann. Bei höheren Organismen sorgen zwar komplexere Mechanismen für die Virusabwehr, aber auch sie brauchen die RNA-Interferenz, um so genannte „springende“ Gene in Schach zu halten. Das sind „Schmarotzer“-Gene, die sich im Erbgut eingenistet haben und sich von Zeit zu Zeit an andere Stellen kopieren. Das tun viele über eine dsRNA Zwischenstufe, was es der RNA-Interferenz erlaubt, regulierend einzugreifen. Dadurch wird ein Ausufern der Kopien verhindert. Erstaunlicherweise stellte sich aber heraus, dass Zellen den gleichen Mechanismus auch nutzen, um ihre eigenen Gene zu regulieren. Dabei existieren im Erbgut Pläne für so genannte Mikro-RNAs (miRNAs), die so aufgebaut sind, dass ihr vorderer und hinterer Teil komplementär sind. Dadurch können sie Haarnadelstrukturen mit doppelsträngiger RNA bilden, die wie körperfremde dsRNA behandelt werden und so die Expression körpereigener Gene kontrollieren können. Es wurde sogar nachgewiesen, dass derartige miRNAs eine wichtige Rolle bei Wachstums- und Entwicklungsvorgängen spielen. [5,8]
2.3 Der Mechanismus der RNA-Interferenz
2.3.1 Dicer und die Spaltung von dsRNA in siRNAs
RNA-Interferenz tritt auf, wenn in einer Zelle lange, doppelsträngige RNA auftaucht. Da diese in der Zelle normalerweise nicht vorkommt, wird sie von Dicer, einer Endonuklease vom RNAse III Typ erkannt und in 19 Basenpaare (bp) lange Duplexe geschnitten, wobei sich auf jeder 3’ Seite jeweils ein 2 bp langer Überhang befindet, sodass die Gesamtlänge eines Stranges 21 bp beträgt. Diese so aufgebauten RNA-Duplexe werden als „small“ oder „short interfering“-RNAs (siRNAs) bezeichnet. [4,10] (siehe Abbildung 1 (1)). Bei Säugetierzellen existiert Dicer zwar auch, dort führt allerdings eine unspezifische Interferonantwort auf lange dsRNA zur Apoptose der Zelle, bevor RNA-Interferenz nachgewiesen werden kann. Will man daher RNA-Interferenz in einer Säugetierzelle auslösen, muss die die zugeführte siRNA wie ein Produkt von Dicer gestaltet sein, das heißt ca. 21 bp lang, doppelsträngig und mit 3’ Überhängen.[11]
2.3.2 RISC und PTGS
Im nächsten Schritt wird die siRNA von einer Helikase entwunden[9] und einer der beiden Stränge (der so genannte „guide“-Strang) in den RNAi-Effektorkomplex oder RISC (RNA-induced-silencing-complex) eingebaut (Abb.1 (2)). Der begleitende „passenger“- oder „sense“-Strang wird abgetrennt und degradiert (Abb. 1 (3)). Obwohl der Enzymkomplex RISC in verschiedenen Formen beschrieben wurde, gibt es dennoch eine wesentliche Gemeinsamkeit, die in dem Vorkommen eines Proteins aus der Argonaut-Familie oder ihrer Homologe besteht. Dabei wurde nachgewiesen, dass das Protein Argonaute 2 (Ago2) verantwortlich für die Nukleaseaktivität des gesamten Komplexes ist. RISC bindet sich über den „guide“-Strang spezifisch an komplementäre mRNAs. (Abb.1 (4)) Wird dabei eine genügende Übereinstimmung zwischen „guide“-Strang und mRNA erreicht, wobei die ersten 10 Nukleotide vom 5’ Ende des „guide“-Stranges besonders kritisch sind, kann Ago2 diese zerschneiden. (Abb.1 (6)) Dabei erfolgt der Schnitt zwischen dem 10. und 11. Nukleotid vom 5’ Ende des „guide“-Strangs.[12] Nach dem Schnitt löst sich RISC von der mRNA um sich weitere, identische mRNAs zu suchen und diese zu spalten (Abb.1 (7)), während die geschnittene mRNA, der jetzt die schützenden Endkappen fehlen, rasch von anderen Endonukleasen abgebaut wird.[13] Dieser Vorgang wiederholt sich so lange, bis die siRNA unter eine therapeutisch wirksame Konzentration verdünnt ist, was in sich schnell teilenden Zellen nach 3-7 Tagen der Fall ist, während es in sich nicht mehr teilenden Zellen mehrere Wochen dauern kann.[14]
Besteht nur eine teilweise Homologie zwischen „guide-Strang“ und mRNA und bestehen die Basenpaarungen größtenteils außerhalb der ersten 10 Nukeotide, so kann RISC sich an die mRNA binden, diese aber nicht zerschneiden. (Abb.1 (5)) Die Bindung führt dann ebenfalls zu einer Inhibition der Translation und damit langfristig auch zu einem Abbau der mRNA, aber jeder RISC kann nur jeweils eine mRNA blockieren, was diese Art der Wirkung gegenüber der vorher beschriebenen deutlich ineffektiver macht. In beiden Fällen wird aber die Translation einer spezifischen mRNA vermindert, was zu einem Rückgang des von ihr codierten Proteins in der Zelle führt.
Da beide Mechanismen die Genexpression erst durch nachträglichen Abbau der mRNA beeinflussen, werden sie zusammengefasst auch als „post-transcriptional gene silencing“ (PTGS) bezeichnet. [4,7,15]
2.3.3 RITS und TGS
Zusätzlich zum oben beschriebenen PTGS kann RNA-Interferenz die Konzentration von mRNAs im Cytoplasma auch über „transcriptional gene silencing“ (TGS), ein direktes Stummschalten von Genen durch Inhibition der Transkription im Nukleus kontrollieren. Obwohl der genaue Mechanismus bei Säugetieren noch kaum verstanden ist, vermutet man, dass dabei mit siRNA beladene Ago-Proteine (beim Menschen Ago1 und Ago2 [16]) in einem „RNA-induced-transcriptional-silencing-complex“ (RITS) direkt an den Chromosomen die Entstehung von mRNA unterdrücken.[17]
Überraschenderweise wurde kürzlich auch entdeckt, dass siRNA, die sich gegen Promotoren auf der DNA richtet, sich unter Umständen sogar fördernd auf die Genexpression auswirken kann. Die Tatsache, dass man sich diese Reaktion noch nicht erklären kann, spricht dafür dass der zugrunde liegende Mechanismus nach wie vor nicht verstanden ist. [18]
2.3.4 miRNAs und ihre Rolle bei der RNA-Interferenz
Wie oben schon erwähnt, wird der Mechanismus der RNA-Interferenz auch natürlicherweise von der Zelle genutzt, um Gene zu regulieren. Lange wurde geglaubt dass die so genannte „junk“-DNA, die nicht für Proteine codiert, aber dennoch mehr als 90% des menschlichen Genoms ausmacht, lediglich „Schrott“, und eigentlich entbehrlich sei. Kürzlich wurde aber herausgefunden dass ein großer Teil davon in Wahrheit für so genannte „mikro-RNAs“ (miRNAs) codiert, die wichtige regulatorische Aufgaben wahrnehmen und sogar für die hohe Komplexität von Eukaryoten verantwortlich gemacht werden. [8]
Wie sich zeigte bilden die Primärtranskripte von miRNAs (pri-miRNAs) von sich aus Haarnadelstrukturen mit dsRNA, (Abb.1 (8)) die in drei Schritten zu einer reifen miRNA verarbeitet werden. Zuerst schneidet noch im Zellkern das Enzym Drosha einen Teil der pri-miRNA ab und bildet dadurch eine ca. 60 bp lange „precursor-miRNA“ (pre-miRNA), die nach wie vor eine Haarnadelstruktur aufweist. (Abb.1 (9)) Anschließend wird diese pre-miRNA durch das Protein Exportin-5 in das Cytoplasma gebracht (Abb.1 (10)), wo sie von Dicer erkannt und in die auch für siRNAs typischen 21 bp langen Fragmente gespalten wird. (Abb.1 (11)) Diese verhalten sich genau wie siRNAs, werden in RISC und RITS eingebaut, und tragen so zur Genregulation bei. Abgesehen von der Herkunft ist der hauptsächliche Unterschied zwischen miRNAs und siRNAs ihre Beeinflussung der Wirkungsweise des RISC-Komplexes. Während künstlich synthetisierte siRNA normalerweise perfekt an eine Zielsequenz angepasst ist und deshalb zu einer Spaltung der betreffenden mRNA führt, wirken miRNAs aufgrund ihrer geringeren Spezifität zumindest bei Tieren vor allem über die unspezifischere Inhibition der Translation und der Transkription. [13,19]
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- Citar trabajo
- Lukas John (Autor), 2010, SiRNA als Ansatzpunkt zur Entwicklung neuartiger Therapeutika, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/170787
